Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка научных основ применения рентгеновских лазеров на свободных электронах для биологических исследований

Докладчик: Теслюк Антон Борисович

Должность: начальник группы вычислительных технологий

Цель проекта:
1.1 Разработка тестовой научно-технологической платформы для изучения на EXFEL(Гамбург) пространственной структуры, кинетики и атомной динамики биологических объектов и процессов с их участием. 1.2 Формирование российско-германской научной сети для проведения исследований в области структурной биологии на EXFEL.

Основные планируемые результаты проекта:
1. разработка набора тестовых объектов для отработки принципиальных вопросов использования РЛСЭ
для изучения структуры и динамики биологических объектов, удовлетворяющих условию иерархичности:
макромолекулы – надмолекулярные структуры (как некристаллические, так и нанокристаллы) – клеточная
органелла
2. определение набора предварительных характеристик для тестовых объектов, необходимых для
интерпретации данных экспериментов на РЛСЭ
3. разработка методов и методик инструментальных подходов для определения предварительных
характеристик структурно-кинетической (структурно-динамической) организации тестовых объектов
4. разработка методов и методик для подготовки объектов к измерениям на РЛСЭ
5. проведение экспериментов по проверке качества отбора тестовых объектов, методов и методик
подготовки объектов, инструментальных подходов для определения предварительных характеристик
объектов, информативности набора предварительных характеристик объектов для проведения измерений
на РЛСЭ.
6. разработка и адаптация методов вычисления характеристических векторов для дифракционных
изображений макромолекулярных объектов и их применение для задач автоматической классификации,
кластеризации, фильтрации экспериментальных данных
Несмотря на то, что рентгеновский лазер на свободных электронах позволяет перейти от
рентеноструктурного анализа с использованием 10 микронных кристаллов к наноразмерным кристаллам,
проблема получения этих кристаллов в случае мембранных белков остается сложно решаемой.
Перспективным методом получения кристаллов мембранных белков является in meso (LCP или
кристаллизация в кубической фазе). Суть этого метода заключается в том, что кристаллизация белка
происходит в матрице, имеющей в своей основе липидный бислой в жидкокристаллической фазе,
организованный специальным образом.
Будет разработан метод кристаллизации in meso, методики экспрессии, очистки, оценки функциональности
представителя класса GPCR CysLT1, являющегося одним из наиболее важных белков в заболеваниях
астмой и аллергическим ринитом. На первых этапах исследований в качестве модельного белка для
исследований закономерностей кристаллизации будет использован мембранный белок халофильных
археабактерий Halobacterium salinarum – бактериородопсин.
В ходе выполнения проекта планируется отработать технологию подготовки образцов для исследования
пространственной структуры родопсина из Exiguobacterium sibiricum (ESR) в липидной мембране липид-
белковых нанодисков.
Одним из актуальных направлений структурных исследований является также изучение ретинальсодержащих
светочувствительных белков (РСБ), обеспечивающих фотоинформационную и
фотоэнергетическую функции организма. К ним относятся сенсорные (светочувствительные зрительные
пигменты животных, сенсорные родопсины микроорганизмов) и фотоэнергетические бактериальные
родопсины (галородопсин, бактериородопсин).
Для отработки технологии получения надмолекулярных некристаллических струкутр, содержащих
светочувствительные белки будет проведена отработка условий получения препаратов мембранных белков
-рекомбинантного бактериородопсина галобактерий и его мутантных форм, отличающихся по своим
фотохимическим и электрохимическим свойствам, получены миллиграммовые количества ESR в составе
ЛБН. Для встраивания ESR в ЛБН будут опробованы два подхода, разработанных исполнителями проекта:
ко-трансляционное встраивание ESR в ЛБН в результате бесклеточного синтеза родопсина в присутствии
ЛБН; реконструкция ESR в мембрану ЛБН из нерастворимой фракции трансляционной смеси.
Также планируется получение, характеристизация и тестирование микрокристаллических образцов
функциональных доменов каталитической субъединицы теломеразы O. рolymorpha (TERT). В качестве
основного объекта предполагается использовать препарат N-концевого домена (остатки 1-153), а также
разработать методики получения других фрагментов TERT, стабильных в растворе в высокой
концентрации. N-концевой домен TERT был уже успешно закристаллизован; в рамках проекта для него
предполагается разработать методику получения микрокристаллов различного размера; наработать
препаративное количество микрокристаллов; использовать образцы в различных тестах, в частности, при
отработке системы введения образцов в пучок.
Для исследования других доменов TERT будет проведен биоинформатический анализ аминокислотной
последовательности TERT и выбраны фрагменты для клонирования и экспрессии; наиболее стабильные
фрагменты TERT будут наработаны в препаративных количествах и проведен скрининг условий их
кристаллизации. Образцы микрокристаллов будут использованы в различных тестах инфраструктуры
XFEL.
В рамках проекта будут исследован ряд различных белков такого класса и/или их функциональных
доменов из модельного организма D.melanogaster . Планируется, в частности, исследовать следующие
инсуляторные белки, а также белки, для которых показано связывание с инсуляторными белками:
1. N- и C-концевые домены белка CTCF
2. ZAD-домены белков CG6654, Serendipity-d, Pita и Zw5
3. BTB-домены белков Tramtrack, Mod(mdg4) и CP190
Будут исследованы гистоноподобные ДНК-связывающие HU-белки из ряда микоплазм.
Структура отобранных индивидуальных объектов, а также их функциональных белок-белковых
комплексов будет исследована взаимно дополняющими методами: рентгеноструктурного анализа
(детализированная структура отдельных белков и/или их функциональных доменов), малоуглового
рентгеновского рассеяния (структура функциональных комплексов низкого разрешения) и, при
возможности, XFEL (структура функциональных комплексов высокого разрешения). Помимо этого в
качестве более простых моделей будут исследованы гистоноподобные ДНК-связывающие HU-белки из
микоплазм.
Будет разработан способ позиционирования объекта в поле рентгеновского пучка, что позволит
значительно повысить отношение сигнал/шум при исследовании структур белков с использованием РЛСЭ.
Так как объект полностью деструктурирует при взаимодействии с мощным рентгеновским импульсом,
необходимо, чтобы к приходу следующего импульса в области пучка попадал такой же новый объект, и его
пространственная ориентация была идентична ориентации объекта при предыдущем скане. Эта задача
будет решаться методом динамических оптических ловушек с помощью модуляции интенсивности
лазерного излучения в ловушке по принципу обратной связи.
Для разработки способа захвата частицы предлагается использовать большую числовую апертуру и такие
мощности лазера, чтобы сила светового давления существенно превосходила силу тяжести частицы. В
данной работе предлагается реализовать следующий алгоритм :а) активировать ловушку только в
непосредственной близости налетающей частицы и затем по принципу обратной связи осуществить
демпфирование движения частицы; б) в зависимости от координат частицы и ее скорости в зоне ловушки
по заданному алгоритму обратной связи подавать требуемый уровень мощности лазера. Теоретическое
моделирование такого захвата и удержания микро- и наночастицы в оптической ловушке в вакууме,
выполненное участниками проекта, показало, что для захвата микро- и наночастицы достаточно
использовать три уровня мощности лазера в и принцип обратной связи модуляции мощности. При этом
показано, что для 1 мкм частицы достижимо демпфирование скорости частицы за время менее
миллисекунды.
Еще одно направление связано с созданием методов математической обработки данных, полученных в
исследованиях на РЛСЭ. Для моделирования структурных и динамических эффектов влияния внешних
условий на структуру и динамику молекулярных и надмолекулярных биообъектов будут использованы
программные пакеты молекулярной динамики (GROMACS, NAMD, AMBER, вспомогательного пакета
PLUMED скомпилированными для работы в параллельном режиме, в том числе с использованием
графических процессоров et al) в варианте полноатомных силовых полей AMBER и CHARMM (семейство
силовых полей AMBER считается более протестированным в отношении моделирования
полинуклеотидов) и coarse grain силового поля типа MARTINI, имеющиеся и специально разработанное
программное обеспечение для конструирования молекулярных и надмолекулярных объектов, обработки
траекторий и визуализации результатов расчетов. Для определения изменения атомных зарядов и
поляризации объектов под действием внешнего электрического поля и ионного состава буферной смеси
будут использованы дополнительно программные пакеты квантовой химии GAUSSIAN. Вычислительные
эксперименты будут производится с использованием технологии параллельных вычислений и
суперкомпьютеров МГУ и НИЦ КИ с пиковой производительностью до 1500 Тфлоп/с.
Для методов обзора значимых областей конфигурационного пространства предлагается использовать ряд
алгоритмов:
1) метод метадинамики – один из наиболее новых и перспективных методов, путем добавления к
гамильтониану системы дополнительных гауссовых членов заставляет молекулярную систему исследовать
все новые и новые области пространства, позволяет преодолевать локальные барьеры свободной энергии,
позволяет вычислять профили свободной энергии вдоль заданных координат реакции.
2) метод обмена репликами – за счет параллельного моделирования систем при нескольких температурах
и наличию Монте-Карло подобного алгоритма обмена конформациями позволяет системе преодолевать
энергетические барьеры
3) метод адаптивной смещающей силы – позволяет вычислять профиль свободной энергии вдоль одной
координаты реакции, ускоряет сканирование фазового пространства вдоль выбранной координаты.
4) методы существенной динамики – позволят выявить скоррелированные конформационные движения в
системе методами ковариационного анализа и в дальнейшем использовать их в качестве координат
реакции для применения методов усовершенствованного сканирования.
5) методы обобщенной координаты пути (path collective variable) – позволяет задавать обобщенную
координату реакции в виде набора структур с плавно меняющимися конформациями. позволяет
использовать эту координату в каком-либо методе ускорения сканирования фазового пространства.


Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Использование рентгеновских лазеров открывает новую эру в структурной биологии и очень гармонично
вписывается в перспективное развитие постгеномных технологий. Уровень развития современной
биологии, биомедицины, фармакологии требует знаний о механизмах биологических процессов в норме и
патологии с атомной точностью. В настоящее время в базах данных содержится информация только о
порядка 90 тысяч из более, чем 6 миллионов белковых структур. Эта информация в подавляющем
большинстве случаев получена методами рентгеноструктурного анализа и относится к кристаллическим
структурам белков в некоторых локально равновесных конформациях. К сожалению, огромное число
белковых структур практически не поддаются кристаллизации или получаемые для них кристаллы имеют
нанометровые размеры и сильные дефекты, что осложняет использование классического
рентгеноструктурного анализа (РСА). Кроме того, классический РСА практически бесполезен для
изучения структуры и динамики биомакромолекул в переходных, функционально активных состояниях.
Преимуществом методов XFEL является способность проводить структурные исследования без
кристаллизации объекта. Существенным преимуществом является также уникальная возможность
получать информацию о структурной динамике в ходе функционального акта с рекордным временным
разрешением порядка десятков фемтосекунд, что принципиально меняет ситуацию и переводит
структурную биологию на качественно новый уровень.
В настоящее время весьма актуальной является разработка тестовых объектов для проведения
исследований на XFEL (Гамбург), методов выделения, очистки, кристаллизации, формирования
надмолекулярных комплексов, алгоритмов, программного обеспечения и протоколов с целью анализа и
интеграции данных рентгеновского (в том числе синхротронного и лазерного) рассеяния, и методов
молекулярного моделирования для исследования структуры и динамики биомакромолекул и их
комплексов.
Развитие этих методов является крайне важной как с точки зрения фундаментальной, так прикладной
науки и имеет первостепенное значение для современной фармакологии и биомедицины. Подавляющее
большинство мембранных белков человека, которые являются мишенями для фармакологического
воздействия не кристаллизуется. Поэтому для изучения их структуры и механизмов взаимодействия с
лигандами XFEL имеет первостепенное значение.

Текущие результаты проекта:
1.1. Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках НИР.
1.2. Проведение патентных исследований в соответствии ГОСТ Р 15.011-96.
1.3. Обоснование выбора направлений и методик исследований.
1.4. Обоснование выбора объектов, методов проведения экспериментов, платформ, аппаратных средств, средств разработки программ, способов представления данных.
1.5. Разработка методов преобразования дифракционных изображений отдельных макромолекул в характеристический вектор.
1.6. Разработка принципов манипулирования и удержания микро- и нано частиц с применением лазеров.
1.7. Биоинформатический анализ архитектурных белков D. Melanogaster, участвующих в формировании инсуляторных комплексов, поиск фрагментов, соответствующих структурным доменам и теоретическая оценка их экспрессируемости и стабильности
1.8. Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей проблему получения наночастиц, содержащих мембранные белки. Обоснование выбора направлений и методик исследований.