Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка мембранного каскадного электродиализатора для сепарации стволовых клеток и факторов роста с использованием функциональных микро-и нанобиопористых мембран

Докладчик: Решетов Игорь Владимирович

Должность: заведующий кафедрой

Цель проекта:
Цель:разработка принципов, методов получения живых биологически активных веществ, стволовых клеток с сохранными рецептороми и факторов роста из жировых тканей, крови человека на основании сочетания методов сепарации с применением микро-и нанопористых мембран, в том числе и аффинных, и принципов каскадного электородиализа. Выделенные целевые компоненты должны соответствовать требованиям, предъявляемым к материалам для изготовления и создания трехмерных наноконструкций для формирования прототипов органов и тканей. Задачами ПНИ являются: 1. Разработка метода простого, быстрого и «деликатного» разделения ультратонких структур и биологически активных компонентов крови и жировых тканей, в частности, таких как стволовые клетки и факторы роста. 2. Отработка методики формирования сложного пространственного 3D матрикса микро-наноперфорированных биосовместимых мембран. 3. Разработка и методики верификации поверхностных биоактивных структур крови и жировой ткани. 4. Оценка сохранности молекул после фильтрации в аспекте дальнейшего применения в медицине и биологии, в частности крайне важно сохранить белковые рецепторы плюрипотентных стволовых клеток для возможности топического воздействия. Возможными путями решения проблемы сепарации стволовых клеток и факторов роста могут являться различные технологии: центрифугирование в градиенте плотности, комплексообразование с последующей седиментацией, фильтрационное баромембранное разделение, цитофлоуметрия, иммунная магнето сепарация, аффинная хроматография, электрофорез и диализ. Все вышеперечисленные методы имеют свои преимущества и недостатки. Однако не один из методов изоляции не является универсальным. Анализ научно-технической литературы показал, что метод каскадного элетродиализа достаточно хорошо зарекомендовал себя в практике препаративного выделения целевых компонентов из сложных биологических объектов как кровь. Применение его позволяет при определенных режимах вести быструю и «деликатную» сепарацию по типу применяемых в микро-и нанофлюидных устройствах. Одним из основных элементов каскадного диализатора являются трековые мембран с различными диаметрами пор от десятков микрон до десятков нанометров. Несмотря на свою простоту и эффективность метод каскадного электродиализа не используется для разделения стволовых клеток и факторов роста. В рамках ПНИ этот метод будет взят за основу разрабатываемой технологии изолирования стволовых клеток и факторов роста. Кроме того придание мембранам аффинных свойств по отношению к выделяемым целевым компонентам позволит повысить селективность процесса.

Основные планируемые результаты проекта:
Объектом исследования ПНИ являются биологически активные вещества крови и жировых тканей, стволовые клетки и факторы роста
Основным результатом работы является устройство каскадного электородиализа для сепарации и изолирования стволовых клеток и факторов роста основанного на применении микро-и наноструктурированных трековых мембран (набор биосовместимых микро-и нанопористых мембран с вариациями размера пор от 15 нм и более) ;
Каскадный мембранный электородиализатор должен обладать: способность к неразрушающей – «деликатной» фильтрации/сепарации компонентов крови, жировой ткани с заданной молекулярной массой и пространственной ориентировкой, а так же сохранения поверхностных рецепторов плюрипотентных стволовых клеток различных биологических сред типа рецептеров к SCF, IL-6, LIF и STAT-3; способность быстрого (не более 1 часа) выделения индивидуальных фракций целевых компонентов из объемов не более 1500 микролитров. Созданная система сепарации позволит упростить и повысить качество получения биологически активных веществ и стволовых клеток из крови и жировых тканей.
Данная разработка открывает широкие возможности для решения различных сложных задач в биологии и медицине. В ходе выполнения ПНИ должны быть получены также следующие научно-технические результаты:
- анализ научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов, относящихся к разрабатываемой теме;
- патентные исследования по разрабатываемой теме .
- экспериментальные образцы биосовместимых микро-и нанопористых мембраны с модифицированной пространственной конфигурацией для каскадного электродиализатора сепарации и изолирования, полностью сохранных биологически активных веществ, факторов роста и стволовых клеток с размером от 15 нм до 1500 нм и факторов роста типа IL-6, LIF, SCF, VGEF, ФНО.
- нанопористых мембран с модифицированной пространственной конфигурацией в сочетании с каскадным электордиализатором для получения сохранных биологически активных веществ, факторов роста и стволовых клеток необходимых для синтеза и пролиферации различных клеток на различных 3D матриксах и скаффолдах, биоинженерного создания новых органов и их фрагментов, а так же для последующего выделения и концентрации полученных биологически активных образцов с помощью хроматофоров.
- экспериментальные образцы биосовместимых микро-и нанопористых мембран с модифицированной пространственной конфигурацией аффинных антител и направленным электродиализом для получения сохранных биологически активных веществ, факторов роста, стволовых клеток с сохранным рецептурным аппаратом, преимущественно гликанов и гликопротеидов (CD31; CD49; CD51; CD61; CD13; CD23; CD44; CD73; CD45: CD133);
- наборы микро-и нанопористых мембран и направленного каскадного электродиализа для получения сохранных биологически активных веществ, факторов роста и стволовых клеток.
Разрабатываемые характеристики метода сепарации и прибора – каскадного мембранного электородиализатора должны обеспечить его конкурентоспособность с существующими зарубежными аналогами в процессах атравматической сепарации/изоляции биологически активных веществ, факторов роста, стволовых клеток.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Получение сохранных биологически активных молекул, фактров роста и стволовых клеток позволит совершить качественный и количественный скачок в современной Российской тканевой инженерии и регенеративной медицине. Упрощение процесса, сделает доступным топическое воздействие на процессы регенерации и репарации тканей в человеческом организме. При этом взаимодествие с коллабораторами на стыке специальностей залог в успешной реализации предложенной нами модели. Уже сейчас процессы мембранного разделения нашли свое применение в современной медицине и биологии, но потенциал их применения достаточно не использован. Разработка также должна быть предназначена для создания опытно-промышленной технологии получения мембран микрои ультрафильтрационного типа с модифицированной пространственной конфигурацией пор и фильтрационных элементов на их основе для применения в существующих и вновь создаваемых безопасных технологиях получения иммуноферментных препаратов, в том числе получения факторов роста, стволовых клеток и других биологически активных веществ. Микро- и нанопористые мембраны должны быть получены на основе полиэфирных пленок (полиэтилентерефталат, поликарбонат, полиэтилентерефталат) на базе принципов ионно-трековой технологии: облучение пленки высокоэнергетическими ионами на ускорителе, сенсибилизация и травление латентных треков в ней. Материал пленки должен быть разрешен для применения в медицине и биотехнологии, что позволяет вести стерилизацию мембран и устройств на их основе разрешенными методами гамма и термической стерилизации без потери их эксплутуационных параметров. Так, благодаря усовершенствованию ионно-трековой технологии получения мембран, должны быть получены химически и термически стойкие, биологически инертные мембраны с порами в диапазоне от 15 до 1000 нм, при этом конфигурация пор должна быть конгруэнтна параметрам заданных клеток и биологически активных частиц. Они должны облададать высокой степенью гидрофильности, узким распределением пор по размерам, биосовместимостью по отношению к разделяемым биологически активным веществам, имеет смысл дополнительно реализовать принципы электородиализного разделения компонентов для увеличения количества живых клеток и биоактивных молекул в ультрафильтрате. Изменения, вносимые в существующую технологию мембран, должны позволить на порядок по сравнению с существующими аналогами (магнитная сепарация, аффинная хроматография, флоуцитометрия) повысить производительность процесса разделения и концентрирования, повысить степень разделения, снизить адсорбционные потери, повысить регенериуемость мембран и позволит получать живые компоненты крови и жировой ткани. Это приведет к повышению эффективности использования мембран в биотехнологических процессах в выделении целевых компонентов из биологических объектов.
Результаты научных исследований проекта по созданию и производству нового класса трековых мембран, в частности ультрафильтрационных, с регулируемыми структурными и поверхностными свойствами, могут быть эффективно использованы и при реализации других проектов: созданию технологических платформ по разработке и производству широкого спектра получению мембран для сепарационных устройств биологически активных веществ, иммунноферментных и генно-инженерных препаратов; липосомальных препаратов, созданию трековых ультрафильтрационных устройств каскадного плазмафереза; созданию фильтров для безопасной инфузионной терапии;; получению диаагностикумов для «блоттинга» белков, ДНК и РНК; мебранных фильтров для санитарно-вирусологического анализа воды и воздуха, базовых ультрафильтров, модифицированных частицами плазмонных металлов для экспресс-анализа биомолекул и вирусов в жидкости и газах с использованием спектроскопии комбинационного рассеяния (Рамановской спектроскопии).

Текущие результаты проекта:
На сенгодняшний момент у соисполнителя проекта - Лаборатории ядерных реакций им. Г.Н. Флерова разработаны научные основы синтеза принципиально нового типа ядерных фильтров – асимметричных ядерных фильтров основанных на принципах супрамолекулярной химии. Впервые экспериментально показано, что присутствие ПАВ оказывает существенное влияние на процесс формирования "трековых" пор при химическом проявлении треков. В отличие от традиционных ядерных фильтров, имеющих поры в виде капилляров цилиндрической формы, асимметричные ядерные фильтры обладают конусной формой пор или имеют тонкий селективный слой, что позволяет существенно (на один-два порядка) увеличить производительность ядерных фильтров при сохранении высоких селективных свойств. Впервые в мире синтезированы высокоасимметричные ядерные ультрафильтры по своим технологическим характеристикам находящиеся на уровне лучших серийных мембран ведущих мировых фирм. Участниками проекта из Отдела трековых мембран ИК РАН разработаны методы химической модификации трековых мембран водорастворимыми комплексообразующими полимерами биотехнологического и медицинского назначения, такими как поли-N-виниламиды, полиэтиленгликоли, поливиниловые спирты, гепарин и т.д. Модификация позволила существенно (от 2 до 50 раз) снизить адсорбцию биологически активных веществ на поверхности мембран, что привело к улучшению их эксплуатационных параметров: увеличивается ресурс работы мембраны, облегчается регенерация мембран, не происходит потерь целевых компонентов в процессе очистки и концентрирования биопрепаратов. Активно ведутся работы по получению трековых мембран с наноструктурированной поверхностью плазмохимическими методами в как полимеризующихся так и неполимеризующихся газов, которые позволяют создавать материалы обладающие уникальными поверхностными свойствами, варьировать химию поверхности, ее гидрофильно-гидрофобный баланс.