Регистрация / Вход
Прислать материал

Создание тканеинженерной конструкции желчного протока на основе биоразлагаемых и биосовместимых материалов с заданными свойствами для воспроизведения многослойных естественных живых структур

Докладчик: Дюжева Татьяна Геннадьевна

Должность: заведующая отделом гепатопанкреатобилиарной и регенеративной хирургии, заведующий отделом

Цель проекта:
Задачей/проблемой, на решение которой направлен проект, является разработка метода создания универсальной трехмерной нанобиоконструкции - тканеинженерной конструкции желчного протока из биосовместимых материалов нового поколения на уровне мировых разработок для придания требуемых свойств биологическим системам, способствующего развитию биологии и медицины. Цель проекта заключается в разработке тканеинженерной конструкции желчного протока на основе биоразлагаемых и биосовместимых материалов с заданными свойствами для воспроизведения многослойных естественных живых структур.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Ожидаемым результатом выполнения проекта является создание экспериментального образца (прототипа) искусственного желчного протока. Для реализации целей и задач проекта будет проведен анализ литературы, нормативно-технической документации, теоретические и экспериментальные исследования в результате которых будет обоснован выбор направления исследований и получены: экспериментальные образцы биосовместимого биоразлагаемого материала и лабораторный технологический регламент его получения, экспериментальные образцы биосовместимого каркаса и лабораторный технологический регламент его получения. Будут разработаны стандартная операционная процедура забора биоматериала-источника клеток, его транспортировки, выделения клеток, культивирования, криохранения и характеризации, лабораторный технический регламент получения тканеинженерной конструкции желчного протока и ее экспериментальные образцы. Планируется, что в результате успешного выполнения исследований и получения тканеинженерной конструкции желчного протока будет подготовлен проект ТЗ на проведение ОКР по теме: «Проведение доклинических испытаний тканеинженерной конструкции желчного протока на основе биоразлагаемых и биосовместимых материалов с заданными свойствами»
2. Экспериментальные образцы тканеинженерной конструкции желчного протокатканеинженерной конструкции желчного протока на основе биосовместимого каркаса и нанобиологического материала должны удовлетворять следующим требованиям: по своим физико-биологическим характеристикам должны быть близки к структурам человеческого тела, включать не менее 3 слоев, быть непроницаемыми для желчи, обладать устойчивостью и способностью к длительному существованию в организме (деградация каркаса в модельных сиcтемах не менее 1 месяца), быть пластичными (относительное удлинение δ до 5% без разрыва при проведении испытаний на растяжение).
Биосовместимый материал для создания каркаса для тканеинженерной конструкции желчного протока должен представлять собой композит, включающий не менее двух биосовместимых компонент. Он должен обладать следующими свойствами: содержать в составе не менее одной компоненты, нерастворимой в воде, иметь волокнистую структуру с диаметром волокон не более 300 нм, быть проницаемым для водных растворов, поддерживать рост и пролиферацию клеток, обладать возможностью модификации сигнальными биологически активными веществами и представлять собой трубку диаметром 3-6 мм, длиной не менее 1,5 см, толщиной стенок – не менее 100 мкм.
3. Новизна научных решений заключается в том, что разрабатываемая тканеинженерная конструкция будет многослойной: состоять из биосовместимого биоразлагаемого каркаса с многослойным клеточным покрытием и включать в себя клетки различных типов. Это позволит наиболее точно отразить структуру нативного желчного протока и сделать конструкцию универсальной, которую можно использовать при повреждениях желчного протока различного вида: пересечение, иссечение. термическое поражение вследствие электрокоагуляции.
4. Разработка соответствует мировому уровню. Для изготовления тканеинженерной конструкции будут использованы материалы и технологии, активно применяемые в ведущих мировых научно-исследовательских центрах, исследовательских группах, занимающихся тканевой инженерией.
5. Пути достижения результатов включают последовательное выполнение этапов по разработке технологии получения нетканного биодеградируемого материала из различных полимеров и выбору наиболее оптимального на основе их сравнительных характеристик, изготовление из полученного материала каркаса-трубки с дальнейшим созданием тканеинженерной конструкции на основе биосовместимого каркаса с клеточным покрытием.
На этапе формирования каркаса основные риски включают в себя недостаточную механическую прочность каркаса и низкую эффективность роста клеток на его поверхности. Оба риска непосредственно связаны с процессом получения биосовместимого волокнистого материала и каркаса из него и могут быть преодолены путем оптимизации процесса электроспиннинга или подготовки каркаса для адекватной адгезии клеток.



Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Исследование новых композитов для матриц-носителей стволовых клеток («тканевых биоконструкторов») на основе биодеградируемых материалов. Разработка новых технологий в сфере регенеративной медицины.
2. Потребителями ожидаемых результатов являются компании-разработчики стентов для медицинской промышленности. Многослойные конструкции на основе биоразлагаемых биосовместимых материалов будут востребованы компаниями, занимающимися фундаментальными исследованиями взаимодействия клеточных культур различного происхождения, в том числе стволовых клеток.
3. Разработанные технологии могут быть востребованы не только для восстановления проходимости желчных протоков, но также для эндопротезирования желудочно-кишечного тракта, мочевыделительной системы и других трубчатых органов, таким образом технологии и продукты будут востребованы компаниями, занимающимися фундаментальными исследованиями и разработками в медицине, в том числе крупнейшими российскими компаниями-интеграторами.
Будет разработана потенциально коммерциализуемая технология, которая позволит создавать новые продукты регенеративной медицины – трубчатые органы, а также создаст задел для разработки более сложных технологий формирования солидных органов.
Разработанные технологии формирования трубчатых тканеинженерных конструкций, безусловно, будут способствовать международному сотрудничеству в области разработки, доклинических и клинических исследований биомедицинских клеточных продуктов. Так, например, при создании первой тканеинженерной трахеи были задействованы ведущие европейские научные и клинические учреждения из более чем 3 государств.
Для российского здравоохранения результаты ПНИЭР будут несомненно важны, т.к. на базе ведущего вуза Минздрава начнет функционировать инфраструктура создания и выведения на рынок новых видов продукции – биомедицинских клеточных продуктов, и будут реализовываться механизмы воплощения инновационных идей в конечный продукт.

Текущие результаты проекта:
На 1 этапе проведены теоретические и экспериментальные исследования, направленные на получение нескольких вариантов биосовместимого материала для создания каркаса тканеинженерной конструкции с использованием электроспиннинга: полиоксибутирата (ПОБ), сополимера полиоксибутирата с полиоксивалератом (ПОБ/ПОВ), полимолочной кислоты (ПМК). Для увеличения эластичности использовали пептиды шелка. Для контроля химической структуры используемых полимеров применяли метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Полученные спектры ЯМР подтвердили структуру полимеров как неразветвленных (отсутствие в образцах полимеров другого строения).
Проведен выбор условий электроспиннинга (расстояние между шприцом и коллектором, угол между направлением иглы и горизонтальной плоскостью, диаметр иглы). Разработана модификация держателя шприца, позволяющая увеличить ход поршня и объем распыляемого раствора. Проведены исследования по выбору оптимального напряжения для распыления конкретного материала, силы приложенного электрического поля для формирования волокон различного диаметра. Изучено влияние скорости потока раствора полимера на пористость получаемых пленок.
В результате проведенных экспериментов получены следующие варианты биосовместимых материалов: волокнистый ПОБ, волокнистый ПОБ/ПОВ, волокнистый полилактид, волокнистый полилактид, содержащий 10% пептидов шелка. Материал получен в виде пленок толщиной до 50 мкм на фольге.
Выбор оптимального материала проводили по 2 критериям: хрупкости и прошиваемости иглой, используемой в хирургической практике (пролен 6/0, фирмы Ethicon). Из 4 исследуемых материалов выбраны 2: волокнистый сополимер ПОБ/ПОВ и полилактид с добавкой пептидов шелка. Чистый ПОБ обладал повышенной хрупкостью, а чистый полилактид прошивался хуже, чем полилактид с пептидами шелка.
Исследована проницаемость выбранных материалов для водных растворов, что необходимо для создания тканеинженерной конструкции с клеточным покрытием для транспорта питательных веществ и сигнальных молекул к клеткам, растущим на пленке (каркасе). Показана проницаемость волокнистых материалов, сформированных методом электроспининга.
Волокнистые образцы исследованы методом рамановской спектроскопии. Полученные спектры соответствуют литературным данным. В дальнейшем анализ рамановских спектров может использоваться для определения степени кристалличности образцов и ориентации молекул в них, эти параметры могут влиять на кинетику биодеградации каркаса.
Также на первом этапе была отработана технология получения и использования клеточных культур мезенхимальных стромальных клеток костного мозга для дальнейшего заселения каркаса. Забор костного мозга осуществляли (после подписания информированного согласия) под местной анестезией в условиях операционной путем пункции гребня подвздошной кости здорового добровольца. Аспират в количестве 150 мл помещали в пробирки, содержащие специальную среду для забора (фосфатно-буферный раствор, содержащий 50 ЕД/мл гепарина и 0,25 мг/л гентамицина). Суспензию клеток костного мозга центрифугировали при 1500 об/мин (350g) 5 минут, осадок клеток ресуспендировали в растворе для лизиса эритроцитов в течение 3 мин и повторно центрифугировали в том же режиме. Гемолизированный супернатант удаляли отсасыванием, а клеточный осадок, свободный от эритроцитарных и тромбоцитарных элементов, ресуспендировали в полной питательной (ростовой) среде DMEM/F12 (Invitrogen, США), содержащей 10% телячью фетальную сыворотку («HyClone Defined», HyClone, США), инсулин 0,4 мкМ, 0,25 мг/л гентамицина. Клетки высевали в количестве 2,0-2,5 млн. кл/мл в культуральных флаконах 175 см2 (Corning, США) и культивировали при 5% СО2, атмосферного воздуха 95%. Через 48 часов неприкрепившуюся клеточную взвесь удаляли. Замену культуральной среды на свежую осуществляли каждые 72 часа. После образования субконфлюэнтного монослоя клетки снимали раствором Версена с 0,25% трипсина, ресуспендировали в полной питательной среде и разливали в новые флаконы, в том числе покрытые раствором коллагена. Таким образом получали клетки до 5-го пассажа включительно и засевали ими культуральный пластик, покрытый раствором коллагена.