Регистрация / Вход
Прислать материал

Биочиповые плазмонные аналитические системы на основе стабилизированных нанодисперсных коллоидов металлов для высокоэффективной экспресс-диагностики

Докладчик: Кузнецов Денис Валерьевич

Должность: Заведующий кафедры, зав. кафедры, Профессор, зам.директора ИНМиН по науке, заведующий кафедрой

Цель проекта:
Целью проекта является разработка новых высокочувствительных аналитических систем на основе стабильных конъюгированных с биомолекулами коллоидных наночастиц металлов с изменяемыми оптическими свойствами, изучение свойств и получение их характеристик. Что позволит проводить мультикомпонентный экспресс-анализ различных биологически активных веществ для ветеринарной и медицинской диагностики.

Основные планируемые результаты проекта:
Одной из наиболее важных и актуальных задач в области аналитической биотехнологии является разработка новых простых методов и устройств, позволяющих осуществлять экспресс-анализы сложных смесей биологически активных соединений в объектах окружающей среды и биологических жидкостях. Обязательными требованиями к ним являются простота выполнения анализа, экспрессность, высокая чувствительность, воспроизводимость результатов, стабильность, относительно низкая стоимость. Такие устройства в некоторых случаях могут осуществлять одновременное количественное определение содержания нескольких веществ (например различных микроорганизмов, аллергенов, пестицидов, антибиотиков и т.д.) в анализируемой пробе в течение реального времени (<15 минут). В литературе такого типа экспресс-тесты получили общее название "быстрых" тестов ("rapid tests"). Эту группу аналитических методов также часто объединяют под эквивалентными по смыслу такими названиями как "анализы на месте" ("point-of-care tests или POC"), "анализы у постели больного" ("doctor's office tests"), "мембранные тесты" ("membrane tests") [ Piia von Lode// Clin.Chem. 2005. V.38. P.591-606]. Исследования по разработке экспресс-устройств для анализа биологически активных
соединений в основном в мире проводятся для целей медицинской диагностики.
Доля средств POC диагностики на мировом рынке медицинских аналитических систем за последние 5 лет выросла в три раза – с 15 до 45%, за счет снижения доли анализов, выполняемых лабораториями. При этом крайне важно, чтобы переход к мультипараметричности (одновременному выявлению многих соединений в микрообъеме пробы) не сопровождался значительным ростом трудоемкости определения. Очевидно, что конкурентоспособны лишь те варианты аналитических систем, в которых сведено к минимуму количество вспомогательных реагентов и используемого специального оборудования, а введение тестируемой пробы непосредственно инициирует специфические процессы в аналитической системе и непосредственно приводит к генерации регистрируемого сигнала. Принципиальное значение имеет возможность быстрого – в течение 5– 15 минут – получения информации о наличии и уровне контролируемых соединений, что позволяет оперативно начать необходимые действия по лечению заболевания. Исследования по разработке экспресс-устройств для анализа биологически активных соединений в основном в мире проводятся для целей медицинской диагностики. В ветеринарии такие исследования начаты лишь в последние годы. Большое внимание уделяется выбору объектов и областей проводимых исследований. К числу приоритетных направлений относится создание ветеринарных экспресс-диагностикумов для выявления таких инфекционных заболеваний, как лейкоз и бруцеллез крупного рогатого скота, чума свиней, ньюкалская болезнь птиц и др.
В основе функционирования таких биоаналитических устройств лежат следующие основные процессы: первоначальное «узнавание» анализируемого вещества в растворе, осуществляемое как правило за счет реализации с его участием эффективных биоспецифических взаимодействий (типа антиген-антитело, взаимодействия между собой фрагментов ДНК и др.), и последующее преобразование в системе, приводящее к "визуализации" таких специфических взаимодействий. Процесс перевода "скрытого изображения" (т.е. образование биоспецифических комплексов) в детектируемый сигнал может быть основан на изменении физико-химических свойств реакционной среды (например, в иммунохимических реакциях преципитации и агглютинации с участием пары антитело - поливалентный антиген) или на введении в реагирующие молекулы детектируемой в очень низких концентрациях метки (например, радиоактивной, ферментной, флуоресцентной или др.). Наличие образующихся комплексов с анализируемым веществом может быть определено либо визуально по образованию в системе осадка или помутнению раствора, либо с использованием соответствующего инструментального оборудования для количественной оценки меченых комплексов, что позволяет вычислять концентрацию определяемого соединения в анализируемой пробе.
В последнее время для решения многих практических задач медицинской и ветеринарной диагностики, а также пищевой промышленности, охраны окружающей среды и др. областей, активно разрабатываются и реализуются иммунохимические экспресс-методы анализа с использованием в качестве меток антител коллоидных частиц металлов, обладающих вследствие нанометровых размеров уникальными физико-химическими и оптическими свойствами.
Наиболее широкое распространение в качестве меток получили наночастицы коллоидного золота [Wilson R.// Chem. Soc. Rev. 2008. V.37. P. 2028–2045]. Размер таких частиц как правило варьирует в пределах 10-50 нм. Основными преимуществами их использования в качестве метки является низкий предел обнаружения наночастиц коллоидного золота как в растворе, так и на поверхности твердых фаз, отсутствие необходимости добавлять специальные реагенты для их визуализации (как, например, субстраты в случае ферментных меток) и достаточно хорошо разработанные разнообразные методы получения биоконъюгатов различных белков, в том числе антител, с такими золотыми наночастицами [ Oliver C. //Methods in Molecular Biology, 2010. V.588. P.369-373]. Интенсивный цвет окрашивания наночастиц золота, характеризующийся максимумом поглощения в районе 520 нм, обусловлен явлением поверхностного плазмонного резонанса, возникающим при взаимодействии видимого светового излучения с наноразмерными частицами золота [Liu X., Atwater M.,, Wang J., Huo Q. //Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2007. V. 58, P. 3–7]. Спектральные характеристики таких наночастиц золота зависят от их размера а также возможного изменения агрегатного состояния частиц в коллоидном растворе, что обуславливает возможность их использования в качестве меток антител для визуализации процессов в аналитических системах, сопровождающих образование иммунокомплексов с их участием [Mirkin C.A., Letsinger R.L., Mucic R.C., Storhoff J.J. // Nature.1996. V.382. P.607–609]. Так, например, образование достаточно больших по размеру ассоциатов золотых наночастиц, обусловленное взаимодействием меченных золотом антител в присутствии анализируемого поливалентного антигена, приводящее к изменения окраски раствора после увеличения ионной силы раствора, положено в основу разнообразных экспрессных гомогенных методов иммуноанализа [Sharma P., Kumar B., C. Suri C.R. Environment and Pollution.V. 1. P.12-19]. Наиболее широкое использование такие метки получили в аналитических устройствах для проведения так называемого латерального проточного иммуноанализа (англ. Lateral Flow Immunoassay) [Geertruida A. Posthuma-Trumpie & Jakob Korf & Aart van Amerongen Anal Bioanal Chem (2009) 393:569–582]. В основе метода лежит совмещение принципов проточного твердофазного иммуноанализа и хроматографии на бумаге (в связи с чем метод иногда называют иммунохроматографическим). Устройство для проведения анализа представляет собой узкую тест-полоску (шириной 4-6 мм и длиной около 7 см), состоящую из прочно фиксированных на пластиковой подложке нескольких примыкающих друг к другу пористых мембран, по которым движется поток жидкости, содержащей анализируемый образец. Мембранные носители содержат заранее иммобилизованные в них реакционные компоненты, позволяющие выявлять наличие в анализируемой смеси определяемого соединения по окрашиванию тестовой зоны аналитической области мембраны.
В основе проведения иммунохроматографического анализа, используемого для определения большинства белковых антигенов, в основе лежит так называемая сэндвич-схема иммуноанализа. На аналитической мембране нанесены два вида антител: в виде первой поперечной тестовой линии предварительно сорбированы и высушены специфические антитела против определяемого антигена, во второй зоне в виде поперечной линии содержатся вторичные антитела против специфических моноклональных антител конъюгата золота. Одна или несколько капель анализируемой жидкости, содержащей определяемый поливалентный антиген, наносится на мембрану для образца. Вследствие высокой пористости мембраны и возникновения капиллярных сил жидкость распространяется по порам вдоль мембраны для образца, перетекает на вторую мембрану, содержащую предварительно высушенный на ней конъюгат специфических меченых антител с наночастицами золота, захватывает его и движется вместе с ним и образцом вдоль аналитической мембраны. Так как константы скоростей взаимодействия соответствующих антител с антигенами как правило достаточно высоки, по мере распространения образца в пораъх мембраны происходит быстрое образование комплексов между анализируемым антигеном и антителами, меченными золотыми наночастицами. При прохождении образовавшихся меченных золотом иммунокомплексов через первую зону в виде поперечной линии, содержащей иммобилизованные вторые специфические моноклональные антитела против определяемого антигена происходит удерживание иммунокомплексов на носителе, что визуально проявляется в виде окрашенной тестовой линии. При отсутствии в анализируемом растворе определяемого антигена окрашивания тестовой линии не наблюдается. В обоих случаях избыток меченных наночастицами золота удерживается вторичными антителами, что проявляется в виде окраски второй контрольной линии.
Для определения низкомолекулярных моновалентных антигенов (гаптенов) используется, как правило, конкурентная схема анализа, основанная на уменьшении в присутствии определяемого гаптена количества меченных золотом антител, связанных в тестовой зоне аналитической мембраны с иммобилизованным аналогом антигена. Результат анализа для такой схемы характеризуется уменьшением интенсивности окраски тестовой полосы при увеличении концентрации определяемого антигена или полным ее отсутствием.
Рассматриваемые системы латерального иммуноанализа характеризуются следующими особенностями. Во-первых, все необходимые для проведения анализа компоненты уже заранее содержатся в используемых устройствах (для анализа требуется всего лишь нанести на мембрану для образца несколько капель анализируемого раствора). Во-вторых, анализ осуществляется в течение достаточно короткого времени (как правило, 5-10 минут), которое обусловлено только скоростью распространения жидкости по мембране, зависящей от пористости и неоднородности структуры. В-третьих, результаты анализа можно регистрировать визуально по интенсивности окрашивания линии на мембране, или с помощью специальных портативных отражательных ридеров.
Наибольшее распространение такого рода быстрые тест-системы получили в медицинской диагностике. Тесты на основе принципа иммунохроматографии предельно просты в использовании и могут применяться на любом этапе оказания медицинской помощи населению, начиная от диагностики непосредственно в кабинете врача при проведении профилактических осмотров, так и в клинико-диагностических лабораториях с высоким уровнем оснащенности.
В течение начального периода исследований и создания иммунохроматографических тест-систем они функционировали по принципу "да" - "нет", т.е. проявление тестовой полосы в реакционной зоне при визуальном способе детекции свидетельствовало о присутствии определяемого антигена в анализируемой жидкости. Развитие технологии получения тест систем и их стандартизация привели к разработке количественных систем латерального иммуноанализа. Оказалось, что в достаточно широком диапазоне определяемых концентраций интенсивность окраски тестовой полосы в аналитической зоне мембраны пропорциональна содержанию меченого компонента, зависящему от концентрации анализируемого вещества в пробе. Многие компании разрабатывали и в настоящее время предлагают портативные устройства, основанные на отражательной фотометрии, позволяющие проводить количественную интерпретацию результатов анализа.
В настоящей работе в качестве основных направлений исследований в этой области можно выделить следующие: поиск новых классов наноразмерных частиц, обладающих уникальными оптическими и другими свойствами для использования в качестве меток молекул антител или антигенов, разработка инструментальных систем их количественной детекции, повышение чувствительности проведения анализа, разработка систем для проведения одновременного анализа нескольких компонентов в одной и той же пробе (мультианализ).
В основу разработки положен принцип проведения иммунохимического анализа в проточных мембранных системах с использованием высокочувствительных детектируемых меток биомолекул. В качестве таких меток предполагается использовать обладающие плазмонными свойствами наночастицы металлов - коллоидное золото и квантовые точки. Данные типы меток позволяют проводить высокочувствительный анализ с использованием флуориметрических детекторов или простым визуальным способом за счет уникальных оптических свойств наночастиц этих классов. Возможность осуществления экспресс-анализа обусловлена быстрой кинетикой протекания реакций антиген-антитело, протекающих в гетерогенных условиях в проточных системах в тонкослойных ячейках или в узких порах мембран с иммобилизованными специфическими компонентами. Проведение одновременного мультикомпонентного анализа в одной исследуемой пробе может быть реализовано за счет точечной количественной иммобилизации нескольких моноклональных антител в различных пространственных зонах мембраны, являющихся аналитическими элементами микрочипов, а также уникальным свойством квантовых точек - зависимостью максимума спектра испускания от их линейных размеров. Используя в качестве меток отличающихся по специфичности антител квантовые точки разного размера, последующее проведение анализа спектра даст возможность осуществить количественную оценку содержания нескольких компонентов в одной пробе.
Полученные биоаналитические системы будут сопоставлены по аналитическим характеристикам (предел определения, продолжительность анализа, производительность, точность). На основании теоретического и экспериментального анализа будут предложены подходы к снижению предела обнаружения в биоаналитических системах, установлены требования к тест-системам, обеспечивающие высокочувствительную диагностику. Эффективность разработанных методик будет подтверждена испытаниями на репрезентативных выборках биопроб. Будет проведена корреляция результатов, получаемых новыми разрабатываемыми и традиционными аналитическими методами; проведена оценка преимуществ предлагаемых методов. На основании результатов апробации будут сформулированы предложения по внедрению в практику разработанных иммуноаналитических систем.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Биоаналитические системы будут сопоставлены по аналитическим характеристикам (предел определения, продолжительность анализа, производительность, точность). На основании теоретического и экспериментального анализа будут предложены подходы к снижению предела обнаружения в биоаналитических системах, установлены требования к тест-системам, обеспечивающие высокочувствительную диагностику. Эффективность разработанных методик будет подтверждена испытаниями на репрезентативных выборках биопроб. Будет проведена корреляция результатов, получаемых новыми разрабатываемыми и традиционными аналитическими методами; проведена оценка преимуществ предлагаемых методов. На основании результатов апробации будут сформулированы предложения по внедрению в практику разработанных иммуноаналитических систем.
Результаты исследования предполагается использовать в области ветеринарной и медицинской экспресс-диагностики, а также в научных целях для изучения и характеристики иммунохимических взаимодействий. Разработанные в ходе выполнения работы методы получения наноразмерных частиц золота и квантовых точек, способы их конъюгирования с белками, методы их регистрации в растворе и на твердой фазе могут быть использованы в разработке различных новых форматов других аналитических систем. На основе установленных в ходе разработки физико-химических закономерностей протекания иммунохимических реакций в проточных системах будут сформулированы общие подходы для разработки новых методов кинетического и проточного иммуноанализа.

Текущие результаты проекта:
Проведён аналитический обзор современной научно-технической, нормативной и методической литературы в области синтеза коллоидов металлов и квантовых точек для использования в системах биологической диагностики. Подготовлен отчёт о патентных исследований по ГОСТ 15.011-96.
Были разработаны требования к характеристикам и физико-химическим свойствам и обладающих плазмонными свойствами наночастиц металлов и полупроводников, используемых в качестве меток биомолекул. Разработаны программы проведения теоретических и экспериментальных исследований в области методов синтеза квантовых точек на основе наночастиц полупроводников для использования в системах биологической диагностики. Проведены исследования существующих методов высокочувствительной детекции наночастиц для создания на их основе систем мультипараметрического иммунохимического анализа.