Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка методов мультипараметрического исследования структуры клеточных макро- и микроносителей с помощью сканирующей зондовой нанотомографии

Докладчик: Агапов Игорь Иванович

Должность: заведующий лабораторией, профессор, доктор биол. наук

Цель проекта:
Исследование микро- и наноструктуры биологических объектов, тканей и материалов имеет ключевое значение для структурной биологии, медицинской диагностики, создания новых материалов и биоинженерных конструкций медицинского назначения. При этом важнейшим требованием для микроскопических исследований подобных объектов (особенно гидратированых гелевых материалов и наноэмульсий) является сохранение и стабилизация ненарушенной нативной структуры на уровне индивидуальных макромолекул, причем как при подготовке объектов, так и при самих измерениях. Целью данного проекта является проведение прикладный научных исследований направленных на создание научно-технологического задела в области разработки новых методов исследования трехмерной микро- и наноструктуры клеточных макро- и микроносителей с помощью сканирующей зондовой нанотомографии. В ходе выполнения проекта будет разработана новая высокоэффективная методика позволяющая исследовать 3D-морфологию биоматериалов и биоинженерных конструкций и пространственное распределение и локализацию их различных компонентов методами СЗНТ при низких температурах. Разрабатываемая методика должна найти широкое применение в области исследования свойств и контроля качества при разработке широкого класса нанокомпозитных биоматериалов, а также в биологических и биомедицинских исследованиях. Кроме того, данная методика и сопутствующее ей оборудование представляет собой самостоятельную ценность, как выводимая на рынок измерительная технология мирового уровня.

Основные планируемые результаты проекта:
При выполнении ПНИ должны быть получены следующие научные и научно-технические результаты:
1. Обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы,
затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ. Обоснование выбора
направления исследований.
2. Прототип экспериментального комплекса для реализации сканирующей зондовой нанотомографии.
3. Техническая документация на прототип экспериментального комплекса СЗМ для реализации
высокоразрешающей зондовой нанотомографии при низких температурах, выполненную по нормам ЕСКД.
4. Научно-методическая документация: лабораторные технологические инструкции и методики получения и клеточных
макро- и микроносителей и исследований их структуры с помощью СЗНТ
5 Результаты экспериментальных исследований и апробации вновь разработанных технических принципов
и методических подходов в форме отчета о выполнении исследований структуры клеточных макро- и
микроносителей с помощью СЗНТ и научных статей в рецензируемых профильных научных изданиях.
6 Результаты патентных исследований и заявки на получение патентов.
7. Проект Технического задания на проведение ОКР по теме «Разработка макета аппаратного-
методического комплекса для мультипараметрического исследования структуры клеточных макро- и
микроносителей с помощью сканирующей зондовой нанотомографии».
Разрабатываемая в ходе проекта научно-техническая продукция направлена на создание уникальных
методов, предназначенных для исследования трехмерных микро- и нано структур биологических и
биополимерных материалов. Предлагаемый подход, сканирующая зондовая нанотомография, основан на
интеграции техник, сканирующей зондовой микроскопии и криоультрамикротомии в рамках одного
устройства.
Разрабатываемые в ходе проекта методики должны обеспечить:
а) возможность изучения микро- и наноструктуры мягких (с температурой стеклования < 0°C) и
гидрогелевых биополимерных клеточных макро- и микроносителей методом сканирующей зондовой
нанотомографии при низких температурах.
б) возможность эффективного изучения микро- и наноструктуры биоискусственных клеточных
конструкций методом сканирующей зондовой нанотомографии без химической фиксации клеток.
в) возможность многопараметрического исследования микро- и нанораспределений локальных физических
свойств, таких как локальная упругость и вязкость в объеме биоматериалов.
г) возможность исследования трехмерной структуры нано- и микропористых биосовместимых матриксов и
биоискусственных клеточных конструкций на их основе с разрешением до 10 нм в плоскости срезов и 50
нм по глубине.
Основная суть задач, поставленных в данном проекте, сводится к проведению исследований и созданию
научно-технического задела в области анализа микро- и наноструктуры биосовместимых клеточных макро-
и микроносителей с уникальными физико-химическими свойствами и контролируемой морфологией на
основе белка фиброина (регенерированного шелка) и альгината и биоискусственных структур на их
основе. Подобное исследование для данного класса биологических материалов и объектов будет
выполнено впервые.
Реализация данных методик и подходов с помощью разрабатываемого прототипа экспериментального
приборного комплекса позволит получать уникальную наномасштабную информацию о трехмерной
структуре клеточных макро- и микроносителей, а так же других биополимерных и гидрогелевых
материалов и биологических объектов, недоступную другими методами микроскопических исследований.
Разрабатываемые методы позволят существенно расширить существующие представления о
наноструктурных особенностях биологических объектов и тканей, нанокомпозитных биологических и
биополимерных материалов, перспективных для применений в регенеративной медицине. Результаты
работ будут иметь важное значение для развития таких критических технологий РФ, как Технологии
диагностики наноматериалов и наноустройств; Нано-, био-, информационные, когнитивные технологии и
Технологии биоинженерии. Это позволяет нам утверждать, что данный проект является чрезвычайно
актуальным.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Результаты, полученные в рамках выполнения данного проекта, могут быть использованы в таких областях,
как: биоинженерия, структурная биология, регенеративная медицина, биотехнология, нанотехнология,
материаловедение, микроскопия высокого разрешения.
Создаваемая в результате выполнения данного проекта измерительная технология трехмерного
многопараметрического анализа объемных наноразмерных структур в макро- и микроносителях на основе
биоматериалов и биоискусственных тканеинженерных конструкциях может быть использована для
решения широкого класса задач, как в научной, так и в производственной сфере. Основной областью
применения подобного оборудования является метрологическое обеспечение нанотехнологических и
материаловедческих исследований и разработок в области биоинженерии, создания и контроля качества
новых фармацевтических препаратов и изделий медицинского назначения и анализа структур биотканей
для целей медицинской диагностики. Данное направление развития современной технологии является
бесспорным государственным приоритетом не только для России, но для подавляющего большинства
технологически развитых стран мира.
Очевидно, что в последующие годы объем бионанотехнологических исследований и разработок и их
внедрение в реальную сферу экономики будет неуклонно наращиваться, что вызвано как необходимостью
улучшения потребительских свойств существующей продукции, так и рядом прочих важных
обстоятельств, например, сокращением производственных циклов. Важность аналитического обеспечения
бионаноиндустрии не подлежит сомнению, и развитие метрологических методик всегда наращивается
пропорционально развитию технологий, в которых они применяются. Основной задачей сканирующей
зондовой нанотомографии, которую планируется развивать в рамках данного проекта, является получение
уникальной информации о нативной трехмерной наноструктуре и распределении физических свойств с
высоким разрешением в объеме нанокомпозитных биоматериалов и биоискусственных структур на их
основе.
Такими возможностями для многих классов биообъектов и биоматериалов не обладает ни одна из
известных на данный момент измерительных методик. Следовательно, вполне оправдано ожидать,
трехмерная сканирующая зондовая нанотомография займет достойное место в ряду хорошо
зарекомендовавших себя и, в большинстве случаев, успешно коммерциализованных технологий таких как
– атомно-силовая микроскопия, электронная микроскопия, конфокальная микроскопия и т.д.
Так же важной целью данного проекта является создание экспериментальных образцов клеточных макро- и
микроносителей и биоинженерных структур и генерация знаний о связи между трехмерной наностуктурой
и биологическими свойствами биосовместимых синтетических и гибридных матриксов, что является одной
из ключевых задач в тканевой инженерии для целей регенеративной медицины.
В качестве основных потребителей научно-технического результата, предполагаемого в данной работе,
могут выступать научно-исследовательские учреждения, внедренческие лаборатории, инновационные и
промышленные предприятия работающие в области приоритетных направлений бионаноиндустрии (нано-
и микробиология, фармацевтика, тканевая инженерия, регенеративная медицина и др.) и других
перспективных направлений (полимеры, нанокомпозитные материалы, биоматериалы) как в России, так и
за рубежом.

Текущие результаты проекта:
К настоящему моменту получены следующие основные результаты в соответствии с Планом-графиком работ и Техническим заданием проекта:
1. Выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы.
Выбраны и обоснованы методы и средства направлений исследований и способов решения поставленных в проекте задач.
Результаты сравнительной оценки вариантов возможных решений исследуемой проблемы с учетом результатов прогнозных исследований, проводившихся по аналогичной тематике.
2. Разработана методика модификации синтезированных из фиброина шелка пористых макроматриксов (с добавлением и без добавления гидроксиапатита) микрочастицами децеллюляризированного внеклеточного матрикса печени крысы.
Данная методика включает в себя децеллюляризацию матрикса, получение микрочастиц матрикса при помощи измельчения в жидком азоте, модификацию синтезированных из фиброина шелка пористых макроматриксов микрочастицами внеклеточного матрикса печени крысы линии Wistar размерами до 1-5 мкм. Разработанная методика и полученные модифицированные макроматриксы соответствуют техническим требованиям, изложенным в Техническом задании. Данная методика является новой и не описана ранее в литературе.
3. Разработана технологическая инструкция получения макроносителей из фиброина шелка, модифицированных микрочастицами
децеллюляризированного матрикса.
4. Изготовлены экспериментальные образцы синтезированных из фиброина шелка пористых макроматриксов с добавлением и без добавления гидроксиапатита в соответствии с Техническим заданием. Матриксы из фиброина шелка были получены методом выщелачивания с использованием в качестве порообразователя частиц хлорида натрия с размером от 50 до 600 мкм, с добавлением микрочастиц гидроксиапатита и без. Количество образцов: 10 шт. с добавлением микрочастиц гидроксиапатита и 10 шт. без добавления микрочастиц гидроксиапатита, размер образцов 2х10 мм, форма образцов цилиндрическая.
5. разработаны технологические инструкции получения пористых макроносителей на основе регенерированного шелка с добавлением и без добавления микрочастиц гидроксиапатита в соответствии с Техническим заданием
6. Выполнены предварительные экспериментальные исследования микро- и нанопористости синтезированных из фиброина шелка макроносителей без добавления гидроксиапатита с применением методов ультрамикротомии и сканирующей зондовой микроскопии при комнатной температуре. Разработанные методы исследований позволяют изучать степень микро- и нанопористости, характерные размеры пор в матриксах и степень взаимосвязанности пор в матриксе.
7. Выполнены патентные исследования.
8. Разработана методики пробоподготовки и предварительной характеризации синтезированных из фиброина шелка пористых макроматриксов с добавлением и без добавления гидроксиапатита и выполнены исследования синтезированных из фиброина шелка пористых макроматриксов с применением разработанной методики пробоподготовки и предварительной характеризации.

Научная публикация на основе некоторых результатов выполненных исследований принята к печати в индексируемый в базе данных Scopus журнал «Российские нанотехнологии/Nanotechnologies in Russia», она будет опубликована в 4-м квартале 2014 г. В статье представлены результаты экспериментальных исследований трехмерной микроструктуры и микропористости синтезированных из фиброина шелка макроносителей без добавления гидроксиапатита.

Опубликована научная статья на основе некоторых полученных результатов ПНИ в журнале RSC Advances, индексируемом в базах данных Scopus и Web of science (импакт-фактор 3.7). В статье представлены результаты выполненных экспериментальных исследований наноструктуры и нанопористости синтезированных из фиброина шелка макроносителей без добавления гидроксиапатита

Полученные за отчетный период результаты полностью соответствуют техническим требованиям к выполняемому проекту, изложенным в Техническом Задании.
Полученные результаты подтверждают перспективность продолжения работ по проекту, и высокую степень новизны и научной значимости запланированных результатов.