Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка наносенсорной биомагнитной тест-системы на основе нуклеиновых кислот для быстрого детектирования заболеваний разной этиологии

Докладчик: Спиридонова Вера Алексеевна

Должность: старший научный сотрудник, доцент, д. б. н.

Цель проекта:
Разработка наносенсорной биомагнитной тест-системы на основе нуклеиновых кислот для быстрого детектирования заболеваний разной этиологии. Данная работа направлена на создание методик и аппаратуры для реализации безразделительной схемы иммуноанализа с использованием магнитных наночастиц и чувствительного магнитометра, регистрирующего изменение скорости броуновской релаксации магнитных наночастиц при связывании присоединенных к ним аптамеров с белками-мишенями, как это делается для пары антитело-антиген. В прикладном плане разрабатываемая наносенсорная биомагнитная тест-система на основе магнитных наночастиц с иммобилизованными аптамерами к белкам, ускоряющим развитие онкологических заболеваний, таким, например, как интерлейкин-6, а также Lon- протеаза, сопровождающая сборку онкобелков, будет основой нового поколения дигностической медицинской аппаратуры.

Основные планируемые результаты проекта:
В ходе выполнения ПНИ должны быть созданы/разработаны:
1.1 Отчет о ПНИ, содержащий, в том числе:
а) обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы по теме исследования;
б) результаты сравнительной оценки вариантов решения научной проблемы и обоснование выбора оптимального варианта направления исследований;
в) изложение методик проведения исследований;
г) результаты экспериментальных исследований;
д) технико-экономическую оценку результатов научных исследований;
е) обобщение и выводы по результатам научных исследований;
ж) предложения и рекомендации по реализации (коммерциализации) результатов научных исследований.
1.2 Отчет о патентных исследованиях в соответствии с ГОСТ Р 15.011-96.
1.3 Научный задел с описанием физических закономерностей формирования высокотемпературных сверхпроводящих (ВТСП) структур.
1.4 Методика поиска и отбора белковых мишеней среди круциальных белков, ускоряющих развитие онкологических заболеваний.
1.5 Методика получения целевых белковых мишеней с различной молекулярной массой (от 22kDa до100kDa).
1.6 Методика получения целевых молекул нуклеиновых кислот (аптамеров) со специфичными свойствами к конкретным белкам-мишеням, ускоряющим развитие онкологических заболеваний.
1.7 Методика модификации и очистки ДНК-аптамеров.
1.8 Методика характеризации структуры модифицированных ДНК-аптамеров.
1.9 Методика характеризации белковых мишеней с различной молекулярной массой.
1.10 Методика изучения комплексообразования ДНК-аптамера с белковой мишенью в растворе.
1.11 Методика присоединения биотинилированного ДНК-аптамера к магнитным частицам различного размера.
1.12 Методика нанесения буферных слоев и сверхпроводящего слоя на поверхность подложек, обеспечивающих согласование кристаллической структуры слоев на наноуровне.
1.13 Методики измерения электрофизических характеристик экспериментальных образцов многослойных ВТСП пленок.
1.14 Методика изготовления чипов трансформатора магнитного потока и ВТСП СКВИДа (сверхпроводящего квантового интерференционного прибора).
1.15 Методика проведения совместных измерений с биохимическим аналитом на разработанной тест-системе.
1.16 Методика характеризации экспериментальных образцов аналита с пришитыми к магнитным наночастицам специфическими аптамерными ДНК.
1.17 Методика изготовления наносенсорной биомагнитной тест-системы на основе нуклеиновых кислот для быстрого детектирования заболеваний разной этиологии.
1.18 Экспериментальные образцы чипов трансформатора магнитного потока и ВТСП СКВИДа.
1.19 Экспериментальный образец измерительной ВТСП СКВИД-системы, составными частями которой являются:
— ВТСП СКВИД с трансформатором магнитного потока,
—электронные цепи вывода сигнала.
1.20 Экспериментальный образец наносенсорной биомагнитной тест-системы на основе нуклеиновых кислот для быстрого детектирования заболеваний разной этиологии, составными частями которой являются:
— измерительная ВТСП СКВИД-система,
— устройства подачи аналита в измерительную ВТСП СКВИД-систему,
— общий корпус.
1.21 Экспериментальные образцы целевых молекул нуклеиновых кислот (аптамеров).
1.22 Экспериментальные образцы целевых белковых мишеней с различной молекулярной массой (от 22kDa до100kDa).
1.23 Экспериментальные образцы аналита с пришитыми к магнитным наночастицам специфическими аптамерными ДНК.
1.24 Проект ТЗ на проведение ПНИЭР по теме: «Разработка получения ДНК аптамеров как перспективного класса терапевтических агентов».
1.25 Проект ТЗ на проведение ПНИЭР по теме: «Разработка высоколинейного ВТСП детектора магнитного сигнала».
1.26 Заявки на получение охранных документов (патентов).
1.27 Публикации по результатам исследований и разработок в научных журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных "Сеть науки" (Web of Science).

В настоящее время в мировой практике комплекс антиген-антитело рассматривается как «золотой стандарт» специфического взаимодействия биомолекул. Это определило использование моноклональных антител (МА) в медицинской диагностике и терапии.
Однако прошедшее десятилетие ознаменовалось существенным прорывом в использовании фундаментальных знаний о ДНК в прикладных работах. До недавнего времени нуклеиновым кислотам приписывали лишь способность к приему и передаче информации, а также структурные свойства. Открытие энзиматических функций, а теперь и регуляторных (ингибирующих) расширило область использования и практического
применения нуклеиновых кислот. Одним из быстро развивающихся направлений является разработка метода дизайна целевых молекул
нуклеиновых кислот - аптамеров (от латинского Aptus – подходящий) - для изучения проблем нуклеиново-белкового узнавания. По способности образовывать специфический комплекс аптамеры, по сути, являются функциональными аналогами антител, поэтому создание аптамеров, обладающих ингибирующим или активирующим воздействием на белки, безусловно актуально. Специфичность взаимодействия искусственного комплекса аптамер-белок, как правило, сравнивают с природным специфическим комплексом антиген-антитело. Константа диссоциации таких комплексов лежит в пределах 10 - 50 нМ. Сравнение свойств антител с аптамерами было проведено в работе [Jayasena S.D. “Aptamers: An Emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics”,- Clinical Chemistry 45, 1628-1650, 1999]. Из ее результатов следует:
1. Процесс идентификации антител начинается с животных, поэтому наработка антител к, например, сильным токсинам представляется малореальной. Кроме того, очень затруднено получение антител против молекул с малой иммуногенностью. Аптамеры, напротив, получаются химическим синтезом, и чисто теоретически аптамеры могут быть получены к любым мишеням. Так как животные не нужны для получения аптамеров, то к токсинам и другим ядовитым веществам могут быть получены аптамеры высокого сродства.
2.Создание гибридом, как правило, проводят на крысах или мышах, поэтому такие антитела можно использовать в диагностических наборах. При переходе к человеку требуется проводить дополнительные процедуры («хъюманизация»). Человеческие антитела, которые подобны антителам другого организма, могут потенциально связаться с другими белковыми молекулами, что приводит к артефактным
результатам. Например, ревматоидные факторы и аутоиммунные антитела часто дают перекрестные реакции (интерферируют) в иммунном анализе.
3.Идентификация и получение моноклональных антител в лаборатории может быть очень дорогим процессом. Химический синтез аптамеров отработан на синтезаторах, стоимость одного шага не превышает 1 доллара.
4.Получение антител и их хранение требует особой тщательности. Замороженные культуры клеток, продуцирующие антитела, должны храниться в разных местах во избежание гибели клеток в одном из хранилищ по независящим от человека причинам. Типично высокий выход моноклональных антител получается при росте гибридомы перитональных животных и очистке антител от асцитной жидкости.
Некоторые гибридомы трудны для выращивания in vivo, что резко сокращает выход антител. Аптамеры – стабильны, растворы аптамеров хранят в обычных холодильных камерах.
5.Получение антител от выделения к выделению меняет их активность, что каждый раз требует оценки ее иммуноанализом. Аптамеры синтезируют химическим синтезом с максимальной аккуратностью. Чистота синтеза проверяется высокоэффективной жидкостной хроматографией и электрофорезом. Они могут быть повторно очищены, если возникает такая необходимость.
6.Оценить "качество" антител в нефизиологических условиях невозможно.
7.Кинетические параметры взаимодействий мишень - антитело не могут быть изменены по желанию.
8.Антитела чувствительны к температуре, при повышении температуры может происходить необратимая
денатурация.
9.Преимущество аптамеров состоит также и в том, что селекция может быть выполнена при различных условиях, что позволяет использовать и нефизиологические условия (буфер, температура). Кинетические параметры, константы ассоциации и константы диссоциации, могут быть изменены по желанию. Аптамеры неиммуногенны. Надо подчеркнуть, что в предклинических исследованиях при использовании 1000-кратных избыточных доз на животных моделях и на человеке, терапевтическое применение аптамеров не вызывало аллергических реакций. Комплексы аптамер-белок могут успешно заменять комплексы антиген-антитело в иммунодиагностических методах, т.к. константы диссоциации комплексов для тех и для других лежат в наномолярной области, а для ряда комплексов аптамер-белок эта величина снижается до пикомолярных величин, что свидетельствует о высоком сродстве взаимодействующих молекул.
Для выделения целевых молекул нуклеиновых кислот (аптамеров) из огромного набора индивидуальных молекул (более 1018), называемого комбинаторной библиотекой был разработан метод SELEX (от англ. Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) [Tuerk C., Gold L. “Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase”, - Science 249: 505-510, 1990]. Ключевой стадией метода SELEX является отбор целевых аптамеров, способных связываться с молекулой-мишенью. Функциональные целевые молекулы составляют лишь незначительную часть исходной комбинаторной библиотеки: 1 аптамер приходится на 10^9 - 10^13 молекул.
Аптамеры представляют собой небольшие однотяжевые молекулы длиной 30-60 нуклеотидных остатков с достаточно сложной трехмерной структурой. Именно она обеспечивает способность аптамеров специфически связывать различные молекулы: от малых лигандов до больших биополимеров, в том числе белков. Сложнейший процесс биосинтеза белковых "узнающих элементов" – антител, который создала природа в течение длительной эволюции, теперь удается моделировать in vitro: отбирать и синтезировать принципиально новые "узнающие элементы" на основе нуклеиновых кислот. Комплексы аптамер-белок могут успешно заменять комплексы антиген-антитело в иммунодиагностических методах, т.к. константы диссоциации комплексов для тех и для других лежат в наномолярной области, а для ряда комплексов аптамер-белок эта величина снижается до пикомолярных величин, что свидетельствует о высоком сродстве взаимодействующих молекул.
В свете всего сказанного выше становится особо актуальной задача создания методик и аппаратуры для быстрого иммуноанализа с использованием аптамеров. Возможным вариантом является попытка создания безразделительной схемы иммуноанализа с использованием магнитных наночастиц и чувствительного магнитометра, регистрирующего изменение скорости броуновской релаксации наночастиц при связывании присоединенных к ним аптамеров с белками-мишенями, как это делается для пары антитело-антиген [ см, например, F. Öijsjön, J. Schneiderman, A. Kalabukhov, A. Astalan, C. Johansson, and D. Winkler, ”A new approach for bioassays based on frequency- and time-domain measurements of magnetic nanoparticles”, - Biosensors and Bioelectronics 25(5), 1008-1013 (2010)]. Данное направление исследований является новым, требует тщательного изучения механизмов связывания аптамеров с магнитными наночастицами, подбора размеров наночастиц для попадания сигнала в частотно-временное измерительное окно магнитометра, создания специализированных высокочувствительных магнитометров. На решение этой актуальной задачи и направлен данный международный проект.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Области применения и способы использования ожидаемых научных и научно-технических результатов данного поискового исследования определены содержанием и целями проекта. Разработанный новый способ безразделительного иммуноанализа после его оптимизации будет применяться в биохимических лабораториях мира.
Безусловной областью применения полученных результатов будет биомедицинская практика. Связывание белка-мишени с магнитными частицами через аптамер поможет исследовать структуры эпитопов как цитокина, так и рецепторов, вычленяя отдельные домены, участвующие в этих процессах. С помощью иммобилизованного ДНК-аптамера можно будет разработать упрощенную тест-систему по определению
концентрации белка интерликина-6 или в в плазме крови или так называемой Lon-протеазы в эпителиальных клетках.

Текущие результаты проекта:
1.1 Выполнен аналитический обзор, содержащий 55 ссылок на современную научно-техническую, нормативную, методическую литературу по целевым свойствам аптамеров и способам построения биомагнитных тест-систем.
1.2 Обоснованно выбраны направления исследований, методов и средств проведения исследований.
1.3 Проведены патентные исследования по ГОСТ Р 15.011-96: проанализировано более 500 источников информации и не выявлено сведений о наличии завершенных исследований и конструктивных реализаций, порочащих новизну проводимых исследований.
1.4 Получены оценки для величины полезного сигнала при размере магнитных наночастиц 150 нм, концентрации 1мг/мл и размещения СКВИДа и объема с аналитом на расстоянии 1мм.
1.5.Разработана методика поиска и выборки белковых мишеней среди круциальных белков, ускоряющих развитие онкологических заболеваний.
1.6 Разработана методика получения целевых белковых мишеней с различной молекулярной массой (от 22kDa до100kDa).
1.7 Получены экспериментальные образцы белков-мишеней различной молекулярной массы в количестве 10 штук.
1.8 Разработана методика получения целевых молекул нуклеиновых кислот (аптамеров) со специфичными свойствами к конкретным белкам-мишеням, ускоряющим развитие онкологических заболеваний.
За счет средств Иностранного партнера:
1.9 Исследованы физические закономерности формирования многослойных ВТСП структур, обечпечивающие получение образцов с критическими температурами, ТС, слоев не менее 77 К и критическими плотностями тока не менее 1,5.10^(4) ампер на квадратный сантиметр.
1.10 Разработана методика нанесения буферных слоев и сверхпроводящего слоя на поверхность подложек, обеспечивающих согласование кристаллической структуры слоев на наноуровне.
1.11 Разработана методика измерения электрофизических характеристик экспериментальных образцов многослойных ВТСП пленок.
1.12 Разработан общий дизайн, спроектированы и изготовлены части измерительной ВТСП СКВИД-системы (ВТСП СКВИД с трансформатором магнитного потока, электронные цепи вывода сигнала).