Регистрация / Вход
Прислать материал

Новые мультифункциональные наноконструкции на основе модифицированных форм альбумина для тераностики злокачественных опухолей

Докладчик: Годовикова Татьяна Сергеевна

Должность: ведущий научный сотрудник (внс), доцент, д.х.н.

Цель проекта:
Разработка универсальной платформы для создания инновационных противоопухолевых препаратов является одним из приоритетных направлений в современной фармации. Когда речь заходит об онкологии, всегда встают два основных вопроса: диагностика и лечение. Тераностика - развивающаяся область интегральной медицины, сочетающая в себе терапию и диагностику, когда врачи используют одну технологию и для диагностики, и для лечения заболевания в ходе общей процедуры. Сведение воедино, т.е. в пределах одной наноконструкции, и диагностики, и лечения является необходимым условием разработки инновационных противоопухолевых препаратов. Актуальным также является внедрение в фармацевтику методологии лигандного взаимодействия для создания лекарственных форм с направленным транспортом действующих субстанций, что дает возможность воздействовать на конкретную мишень и в десятки раз снизить количество противоопухолевых препаратов, а также в значительной степени избежать побочных действий и осложнений. Цель проекта – развитие методологических подходов к получению мультифункциональных наноконструкций для тераностики злокачественных опухолей, более эффективных и менее токсичных, с программированным высвобождением активной фармацевтической субстанции. Конечным продуктом при выполнении проекта будут созданные на основе клинически значимых форм транспортного белка крови (альбумина) биосовместимые мультифункциональные наноконструкции, обеспечивающие: 1) высокую плотность посадки лекарственного средства; 2) эффективную доставку лекарства к месту воздействия на опухоль с минимальным неспецифическим захватом; 3) высвобождение лекарства после доставки в клетки мишени; 4) возможность высокой чувствительности обнаружения опухоли и исследования фармакокинетики препарата методами МРТ/ЯМР in vivo на ядрах 19F. Основным результатом проекта, определяющим его место и роль в решении проблем фармацевтической тераностики, будет разработка оригинальных мультифункциональных наноконструкций для тераностики злокачественных опухолей, обладающих широким спектром полезных фармакологических свойств.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Результатами выполнения проекта будут:
- лабораторная методика получения на основе клинически значимых форм альбумина биосовместимых мультифункциональных наноконструкций для тераностики злокачественных опухолей;
- лабораторные образцы лиганд-ориентированных мультифункциональных наноконструкций;
- сравнительный анализ тестирования лиганд-ориентированных мультифункциональных наноконструкций в системах in vitro – на культурах опухолевых клеток, и in vivo, с использованием экспериментальных животных, инфильтрированных опухолью.

Функциональная аннотация конечных продуктов гликирования белков при раке, осуществляемая в рамках проекта партнером из Индии, будет оригинальным результатом в области молекулярной медицины, который будет способствовать рациональному дизайну белка-транспортера при решении задачи создания терапевтических наноконструкций с направленным транспортом действующей субстанции.

2. Лабораторная методика получения лиганд-ориентированных мультифункциональных наноконструкций для тераностики, будет включать:
- метод декорирования человеческого сывороточного альбумина и его гликированной формы стабилизатором стерической конфигурации (полиэтиленгликоль) и адресной молекулой (биотин, или фолиевая кислота, или тамоксифен, или селектин);
- метод конъюгирования через рН-лабильную связь противоопухолевого фтормеченного нуклеотида с лиганд-ориентированным белком-транспортером, несущем остатки маскирующей молекулы, (получение химиотерапевтического блока);
- метод введения 19F ЯМР метки в человеческий сывороточный альбумин (19F ЯМР детектируемый блок);
- метод введения азидной группы и остатка алкина в модифицированные формы альбумина (химиотерапевтический блок и 19F ЯМР детектируемый блок) для последующего получения мультифункциональных наноконструкций через лигирование по Хьюсгену;
- метод иммобилизации на поверхности золотых наночастиц мультифункциональных наноконструкций.

Лабораторные образцы мультифункциональных наноконструкций должны содержать:
- фосфорилированную форму противоопухолевого нуклеозида (пиримидиновый нуклеозид трифтортимидин) (агент для химиотерапии и для контрастирования изображения при МРТ, не менее 10 остатков на одну молекулу наноконструкции);
- наночастицы золота (платформа для сборки наноконструкции, агент для фототермальной терапии и для контрастирования изображения в оптических методах визуализации, размер не более 20 нм);
- биотин, или фолиевую кислоту, или тамоксифен, или селектин (биомаркеры для специфического связывания наноконструкции с мембраной опухолевых клеток, Kd не менее 10-5М);
- гликированный альбумин (белок-транспортер наноконструкции в опухолевую клетку, с остатками глюкозы в количестве не менее 10);
- фторированный N-гомоцистеин-содержащий альбумин (белок с 19F ЯМР метками для усиления контрастирования изображения при МРТ, детекции наноконструкции методом 19F ЯМР in vivo при концентрации не более 10-4М);
- группировку, обеспечивающую рН-зависимое высвобождение терапевтического агента внутри клеток (5'-моно- или 5'-трифосфата-5-трифторметил-2'-дезокусиуридина);
- полиэтиленгликоль (маскирующий агент для минимизации связывания с опсонином и захвата ретикуло-эндотелиальной системой).

Оптимальная для тераностики мультифункциональная наноконструкция должна обеспечить:
- увеличение продолжительности жизни в группе экспериментальных животных не менее 50 %;
- достижение противоопухолевого эффекта на экспериментальных животных (мыши) при максимальной терапевтической дозе, не превышающей 100 мг/кг;
- отсутствие снижения или уменьшение не более, чем на 20 % массы тела при введение максимально допустимой дозы;
- детекцию препарата в организме модельного животного при введении дозы не более 100 мг/кг.

3. Существенным отличием создаваемых на основе модифицированных форм альбумина мультифункциональных наноконструкций от описанных в литературных источниках, будет – возможность реализации на их основе технологий адресной доставки лекарств к опухолевым клеткам и получения 19F-изображений в МРТ-анализе.

4. Основные исследовательские компании, работающие в области биотехнологий рака и создающие мультифункциональные наноконструкции для тераностики злокачественных опухолей, локализованы преимущественно в США, Европе, Израиле, Японии и Китае: IBC Pharmaceuticals, Inc., (IBC) (http://www.immunomedics.com/ibc); Massachusetts General Hospital (http://www.massgeneral.org/); The University of Texas. The Biomedical Engineering Department (http://www.bme.utexas.edu/research); Immunomedics, Inc. (http://www.immunomedics.com/); Bar-Ilan University BIU, IL (http://www1.biu.ac.il/indexE.php); KONINKL PHILIPS ELECTRONICS NV (http://www.healthcare.philips.com/), IgDraSol Inc.-дочерняя компания Sorrento Therapeutics, Inc. США, проводящей исследования и разработки агентов для химиотерапии рака. На основании исследования географии патентования следует отметить, что ряд изобретений ведущих разработчиков в данной области проходят процедуру патентования в Российской Федерации (выявлено 15 изобретений). Наиболее активное патентование разрабатываемого объекта наблюдается по следующим направлениям исследований:
- создание наноразмерных конструкций (10-200 нм),
- создание транспортного агента, эффективно доставляющего терапевтический препарат к месту воздействия на опухоль с минимальным неспецифическим захватом,
- обеспечение высокой визуализацию опухоли и возможность мониторинга лечения.

Рынок препаратов для диагностики рака и таргетных противоопухолевых средств развивается стремительно. Тем не менее, в мировой практике на сегодняшний день нет прямых аналогов продукции, разрабатываемых в данном проекте – об этом свидетельствует анализ патентов, проведенный по этой тематике на сайтах патентных ведомств США, Японии, Германии, Дании, Франции, Канады, Китая, Южной Кореи и др. Большинство современных нанотерапевтических систем касается ограниченного числа препаратов, разрешенных к применению, таких как паклитаксел и доксорубицин. С использованием данных фармацевтических субстанций разработаны наноконструкции на основе альбумина для тераностики: препараты с альбумином, агрегированные с 99mTc для однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (single-photon emission computed tomography, SPECT), PulmiteR and NanocollR, и препараты, несущие альбумин-связанные хелаты гадолиния для магнитно-резонансной томографии (МРТ), AblavarR. SPECT имеет меньшее пространственное разрешение, чем МРТ и использует ионизирующее излучение. С помощью метода МРТ можно легко регулировать контраст получаемого изображения и количественно определять различные вещества в динамике in vivo. Однако в случае ковалентных альбумин-связанных хелатов гадолиния, таких, например, как альбумин-(Gd-DTPA)30, длительное время циркуляции ковалентно-связанного Gd-DTPA увеличивает вероятность высвобождения высокотоксичного Gd3+ из комплекса в кровеносное русло. Этот фактор риска ограничивает использование альбумин-(Gd-DTPA)30 и его аналогов в преклинических исследованиях. Выбор исполнителями проекта для визуализации в качестве репортёрной группы фторорганических соединений обусловлен высокой чувствительностью ЯМР на ядрах фтора (19F) и оптимальным соотношением сигнала и шума за счет крайне низкого содержания фтора в живых организмах. Сведение воедино, т.е. в пределах одной молекулы, белка-транспортера с 19F ЯМР меткой и фармацевтической субстанции – фторпиримидина и применение метода ЯМР спектроскопия in vivo обеспечат, с одной стороны, контроль доставки наноконструкций к клеткам мишени, а с другой, позволят исследовать на уровне организма фармакокинетику и метаболизм мультифункциональных терапевтических наноконструкций.

5. Для достижения заявленных результатов должны быть проведены:

- комплексная оценка структурных компонентов мультфункциональных наноконструкций для тераностики злокачественных опухолей через постадийный аналитический контроль промежуточных продуктов;
- исследование структуры мультифункциональных наноконструкций с использованием методов: ЯМР, ИК- и УФ-спектроскопия, лазерной коррекционной спектроскопии, анализа функциональных групп, электрофореза;
- исследование чистоты экспериментальных образцов (сопутствующие вещества) с использованием методов: ЯМР, УФ-спектроскопия, масс-спектрометрия, электрофорез, жидкостная хроматография;
- оценка прямого цитотоксического эффекта мультифункциональных наноконструкций и выявление возможной дифференциальной чувствительности опухолевых клеток различного генеза к изучаемым наноконструкциям;
- оценка противоопухолевого эффекта по торможению роста опухоли в динамике и по увеличению продолжительности жизни экспериментальных животных;
- оценка предела необходимого локального накопления мультфункциональных наноконструкций в органах и тканях животных для регистрации наноконструкций методом in vivo 19F ЯМР и получения объемного МРТ-изображения;
- стандартизация мультифункциональных наноконструкций для тераностики в соответствии с требованиями, предъявляемыми к идеальным наноконструкциям для тераностики. Мультифункциональная наноконструкция должна иметь: малый размер (до 200 нм); обеспечивать высокую плотность посадки лекарственного средства; эффективно доставлять лекарство к месту воздействия на опухоль с минимальным неспецифическим захватом; обеспечивать высвобождение лекарства после доставки; быть биосовместимой; обеспечивать высокую чувствительность обнаружения (визуализации) опухоли.


Экспериментальные образцы мультифункциональных наноконструкций должны быть изготовлены в соответствии с разработанной лабораторной методикой. Разработка экспериментальных образцов мультифункциональных наноконструкций должна включать стадии декорирования человеческого сывороточного альбумина стабилизатором стерической конфигурации и адресной молекулой; стадию конъюгирования через рН-лабильную связь противопухолевого фтормеченного нуклеотида; стадию введения 19F ЯМР метки; стадию введения азидной группы и остатка алкина с последующим лигированием по Хьюсгену; стадию иммобилизации на поверхности золотых наночастиц.

Унификация мультифункциональных наноконструкций для тераностики должна протекать по принципу модульности, обеспечивающейся взаимозаменяемостью вводимых функциональных групп и стандартизацией методов их внедрения.

Биология – наука очень сложная, здесь ничего нельзя знать заранее. Несмотря на полную непредсказуемость результатов биологических исследований, работа над новыми лекарствами в России продолжается. Для снижения риска получения отрицательных результатов при проведении биологических испытаний исполнителями проекта будет изготовлено не менее трех экспериментальных образцов мультифункциональных наноконструкций.





Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Разрабатываемая тема соответствует мировому уровню, поскольку нацелена на создание противоопухолевых препаратов нового поколения – эффективных и селективных мультифункциональных наноконструкций для тераностики злокачественных опухолей, конкурентоспособных на мировом рынке. В перспективе можно рассчитывать на масштабное позиционирование на мировом рынке Российской продукции для тераностики, поскольку существует устойчивая тенденция увеличения масштабов спроса в области использования наноконструкций в терапии и диагностики раковых заболеваний. Мультифункциональные наноконструкции будут разрабатываться исполнителями проекта из России и исследоваться на цитотоксичность и противоопухолевую активность с использованием биологических моделей, созданных исполнителями проекта из Индии. Наличие среди исполнителей проекта специалиста физика обеспечит возможность проведения работы по исследованию потенциала наноконструкций для тераностики злокачественных опухолей методами 19F ЯМР спектроскопии in vivo и 19F МРТ.

На результаты интеллектуальной деятельности, полученные в рамках выполнения проектов, предполагается получить не менее трех патентов. Предполагается, что полученные научные результаты, будут представлены на Международных и Российских конференциях по нанотехнологии и биомедицине. По результатам исследований и разработок будет опубликовано 6 статей в научных журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных «Сеть науки» (Web of Science). Результаты будут включены в курсы лекций по биоорганической химии и биохимии для студентов и аспирантов Новосибирского государственного университета. Планируется подготовить к защите диссертации по разрабатываемой теме не менее двух молодых исполнителей проекта.

Текущие результаты проекта:
На основании всестороннего поиска в базах данных http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed, http://www.sciencedirect.com/, http://www.elsevier.com/, http://pubs.acs.org/journal/jacsat информационных источников за период 2009 – 2014 гг., подготовлен аналитический обзор по данным информационных источников, затрагивающих научно-техническую проблему, исследуемую в рамках проекта, а именно проблему получения лиганд-ориентированных мультифункциональных наноконструкций для тераностики злокачественных опухолей.

Выполнены патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96 и оформлен отчет по теме, касающейся получения наноконструкций на основе модифицированных форм сывороточного альбумина для диагностики и лечения злокачественных опухолей.

Аналитический обзор информационных источников и патентный поиск обеспечили получение достоверных данных об уровне технике, тенденциях развития и патентной чистоте исследуемого объекта: выявлены компании, оперирующие на рынке нано- и биотехнологий рака; проведен анализ применимости в объекте исследования известных объектов интеллектуальной собственности и сформированы предложения по их использованию при разработке данной темы. Результаты анализа научно-технической документации указывают на то, что на данный момент актуальной задачей является разработка универсальной платформы для создания инновационных противоопухолевых препаратов для фармацевтической тераностики. Решение данной задачи будет определяться созданием на основе сывороточного альбумина систем-носителей в форме наночастиц для клеточно-специфического обогащения действующих лекарственных веществ. Результаты информационных источников свидетельствуют о том, что запланированные исполнителями проекта исследования по установлению роли конечных продуктов гликирования в патогенезе раковых заболеваний прольют свет на целесообразность использования определенных форм альбумина в качестве структурных компонентов наноконструкций, разрабатываемых для тераностики злокачественных опухолей. По результатам комплексной оценки структурных компонентов мультфункциональных наноконструкций для тераностики злокачественных опухолей осуществлено обоснование выбора оптимального варианта направления исследований для решения проблемы, касающейся получения мультифункциональных наноконструкций.