Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка высокопроизводительной технологии и установки для изготовления микрофлюидных устройств для культивирования клеток.

Докладчик: Поромов Артем Андреевич

Должность: ведущий научный сотрудник

Цель проекта:
Цель проекта – разработка методологии доклинических исследований токсичности и биотрансформации лекарственных средств invitro.

Основные планируемые результаты проекта:
Задачи:
1. Получение экспериментальных образцов клеточной модели печени человека для оценки токсичности и биотрансформации лекарственных средств;
2. Разработка протоколов культивирования экспериментальных образцов клеточной модели печени человека в различных условиях.
3. Обоснование выбора исследуемых лекарственных средств для оценки информативности методики гепатотоксичности и биотрансформации
4. Разработка макета специализированного микрофлюидного биочипа для культивирования экспериментальных образцов клеточной модели печени человека с целью исследования токсичности и биотрансформации лекарственных средств invitro.
5. Разработка методических рекомендации доклинической оценки токсичности и биотрансформации лекарственных средств в системах in vitro с имитацией микроциркуляции.

В качестве объекта исследования предлагается использовать иммортализованную клеточную линию гепатоцитов человека HepaRG, академическая лицензия на использование которой в экспериментальных целях получена Заявителем у разработчика клеточной линии - компании BioPredic, 07.02.2013. Для создания клеточных моделей будут использованы клетки с 10 по 20 пассажи.
Для решения поставленных задач планируется проведение исследований острой гепатотоксичности ксенобиотиков и процессов их биотрансформации с использованием трехмерных клеточных моделей печени на основе клеток линии HepaRG, культивируемых в культуральных планшетах и в условиях микробиореактора. В отношении разрабатываемых методик необходимо экспериментально обосновать выбор способа культивирования клеточных моделей печени человека (статический – в планшетах, или динамический – в условиях тока питательной среды) для чего планируется провести сравнительное исследование жизнеспособности клеток в составе сфероидов (МТТ-тест, исследование маркеров клеточной гибели клеток (апоптоз, некроз) методами флуоресцентной микроскопии) и их метаболической активности (по активности синтеза альбумина, а также по степени проникновения тестового ксенобиотика в клетки сфероида от его края в центральные области клеточного образования). Также, для оценки метаболической активности клеток, предполагается исследование динамических параметров (не менее трех точек) изменения концентрации тестируемого вещества в результате его биотрансформации методами количественной аналитической химии – хроматографии и/или масс-спектрометрии. Методами иммуногистохимии и ПЦР будут проведено сравнительное исследование экспрессии основных ферментовсемейства цитохрома Р 450 (CYP3A4, CYP1A2, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 и CYP2E1) и транспортера Р-гликопротеина в моделях печени, культивируемых в статических и динамических условиях. На основании сравнительных исследований будет обоснован оптимальный для решения поставленных методических задач способ культивирования клеточной модели печения человека. С учетом воспроизводимости и статистической достоверности изменения количественных параметров,характеризующих жизнеспособность гепатоцитов в составе клеточной модели в ответ токсическое повреждение различными концентрациями контрольного ксенобиотика, будет установлен диапазон информативности разработанной клеточной модели печени человека при исследовании
гепатотоксичности. Также предполагается разработка макета специализированного биочипа для обеспечения реализации разрабатываемых методик, предполагающих скриниговые исследования в большом количестве повторов. Для получения и экспериментального исследования клеточных моделей планируется использование оборудования ЦКП «Постгеномные и метаболомные методы исследования в молекулярной биологии» и ранее разработанного Заявителем микробиореактора «Homunculus», обеспечивающего микроциркуляцию питательной среды.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Основными Научно- техническими результатами ПНИ будут:
-результаты теоретических изысканий;
-результаты патентных исследований;
-гистотипическая клеточная модель печени человека, пригодная для доклинического исследования токсичности и биотрансформации лекарственных средств in vitro;
-протокол культивирования разработанной клеточной модели печени в условиях циркуляции клеточной среды;
-методика доклинической оценки гепатотоксичности лекарственных средств в системах in vitro с имитацией микроциркуляции;
-методика доклинического исследования биотрансформации лекарственных средств в системах in vitro с имитацией микроциркуляции;
-макет специализированного микрофлюидного биочипа для обеспечения реализации разработанных методик;
-проект ТЗ на ОКР «Организация опытного производства специализированного биочипа для обеспечения исследований гепатотоксичности и метаболизма лекарственных средств in vitro»;
-рекомендации по реализации результатов ПНИ в реальных секторах экономики.
Предварительный литературный и патентный поиск в предметной области предлагаемого исследования позволяет утверждать, что оно является актуальным и соответствует критерию новизны. Впервые предлагается исследовать влияние перфузии культуральной клеточной среды, имитирующей микроциркуляцию, на жизнеспособность и метаболическую активность клеток печени, культивируемых в виде трехмерных образований – сфероидов. Для этого планируется использовать специальное устройство для культивирования клеток - микробиореактор, способный обеспечивать автоматизированный поток питательной среды, омывающий клеточные образования, по основным параметрам (скорость, равномерность потока) наиболее приближенный к физиологическим параметрам микроциркуляции в печени человека. Впервые будут получены данные о жизнеспособности и метаболической активности клеток печени человека, культивируемых в виде сфероидов, в зависимости от способа культивирования клеток (статический, динамический). Впервые предлагается разработать и экспериментально обосновать новый методический подход к исследованию in vitro гепатотоксичности и процессов биотрансформации ксенобиотиков в клетках печени человека, а также межлекарственных взаимодействий комбинации ксенобиотиков при их одновременном назначении, основанный на использовании клеток линии HepaRG, культивируемых в виде сфероидов в условиях имитации микроциркуляции.
Основная область применения ожидаемых результатов – сертификационные испытания лекарственных средств на доклиническом этапе в части особенностей их метаболизма и безопасности для здоровья человека. Заявитель планирует инициировать процедуру экспертной оценки информативности разработанных методик с целью решения вопроса о придании им статуса нормативных национальных методик. Согласно официальной статистической информации, опубликованной на сайте Министерства здравоохранения России, ежегодно выдается не менее 400 разрешений на клинические испытания лекарственных средств. Все они проходят предварительные доклинические испытания на базе сертификационных испытательных центров. Разрабатываемые методики относятся к категории краткосрочных лабораторных тестов, обладают высокой информативностью, включая прогнозирование видоспецифической токсичности ксенобиотиков для клеток печени человека, а также будут содержать алгоритм доклинической оценки биотрансформации лекарственных средств в аспекте межлекарственного взаимодействия, исследование которой в настоящее время осуществляются, в основном, на добровольцах.
Внедрения в практику разработанных методик повысит информативность доклинических исследований, сократит их продолжительность, снизит себестоимость, позволит уменьшить количество лабораторных животных, используемых в тестах in vivo, что будет способствовать гармонизации национальной и международной нормативно-правовой базы в области оборота лекарственных средств. Разрабатываемые методики и клеточные модели могут также эффективно использоваться разработчиками лекарственных средств на этапе предсертификационных доклинических исследований.
Потенциальными целевыми потребителями ожидаемых результатов ПНИ являются:
-НИИ, научные лаборатории, центры и иные организации и учреждения, специализирующиеся на разработке лекарственных средств;
-Центры коллективного пользования, предназначенные приборно-методического обеспечения доклинической разработки лекарственных средств;
-Организации, уполномоченные на проведение сертификационных доклинических испытаний безопасности лекарственных средств;
-Организации, специализирующиеся на производстве исследовательского и испытательного оборудования с использованием микрофлюидных технологий.

Текущие результаты проекта:
В ходе выполнения проекта разработаны экспериментальные образцы клеточной модели печени человека на основе трехмерных структур, представленных дифференцированными клетками линии HepaRG. Оценена их жизнеспособности при культивировании в микробиореакторе, разработанном ООО НТЦ «БиоКлиникум» и в планшете с помощью МТТ-теста, цитофлуориметрического исследования, полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. Кроме того, исследована метаболическая активность клеток в составе клеточной модели печени по исследованию уровня синтеза альбумина и мочевины, а также уровню экспрессии мРНК генов, кодирующих ферменты, участвующие в метаболизме ксенобиотиков. Выявлен оптимальный режим циркуляции питательной среды при культивировании образцов клеточной модели печени в микробиореакторе.
Теоретически обоснован выбор контрольного лекарственного вещества, предназначенного для оценки степени биотрансформации при культивировании в условиях без (планшет) и с (микробиореактор) циркуляцией питательной среды. Более того, при хроматографическом исследовании выявили, что клетки в составе клеточной модели печени человека в большей степени метаболизируют контрольное вещество при циркуляции питательной среды.
Кроме того, теоретически обоснован выбор исследуемого вещества при анализе выраженности его гепатотоксичности и проведен полногеномный транскриптомный анализ для оценки механизмов реализации гепатотоксичности на разработанной модели печени.
Исходя из полученных данных возможно заключить, что культивирование клеточной модели печени человека в условиях циркуляции питательной среды ex vivo в МБР, разработанном в ООО НТЦ «БиоКлиникум», может служить новым подходом для оценки гепатотоксического действия лекарственных веществ.