Регистрация / Вход
Прислать материал

Изучение молекулярных механизмов метастазирования при раке предстательной железы в ксенографтных моделях

Докладчик: Шкурников Максим Юрьевич

Должность: старший научный сотрудник

Цель проекта:
Получение значимых научных результатов, позволяющих создать математическую модель и реагенты для прогноза метастазирования рака предстательной железы на основе анализа экспрессии мРНК, в рамках совместного исследования с Институтом анатомии и экспериментальной морфологии Университетского медицинского центра Гамбург-Эппендорф (Гамбург, ФРГ).

Основные планируемые результаты проекта:
Для достижения поставленной цели будут решены следующие задачи:
1) Изучить экспрессию интегрина бета 4 методом проточной цитофлюориметрии в клеточной линии рака предстательной железы PC3 дикого типа и с подавленной экспрессией гена интегрина бета 4;
2) Исследовать транскриптом ксенографтов рака предстательной железы дикого типа и с подавленной экспрессией гена интегрина бета 4 с использованием микрочипов платформы Affymetrix;
3) Разработать математическую модель для прогноза метастазирования рака предстательной железы на основе анализа экспрессии мРНК;
4) Разработать реагенты для определения экспрессии генов, вошедших в математическую модель, методом количественной ПЦР;
5) Разработать проект технического задания на проведение ОКР: «Разработка многопараметрической диагностической тест-системы для прогноза метастазирования рака предстательной железы».

Оценка экспрессии интегрина бета 4 методом проточной цитофлюориметрии
Партнером из Германии будет получена клеточная линия РПЖ PC3 с подавленной экспрессией гена интегрина бета 4 методом shRNA. Для количественной оценки эффективности подавления экспрессии на уровне белка мы планируем использовать метод проточной цитофлюориметрии. При помощи проточного цитофлюориметра Attune (Applied Biosystems, США) и флюоресцентно меченных антител против интегрина бета 4 мы определим исходный уровень экспрессии данного гена в клеточной линии дикого типа и остаточный уровень после подавления в измененной клеточной линии.

Анализ транскриптома
Полученные немецкими партнерами образцы ксенографтных опухолей мы планируем подвергнуть анализу с использованием микрочипов модификации Gene Array 1.0 ST платформы Affymetrix. Данный анализ позволит определить профиль экспрессии генов на уровне всего транскриптома, включая не только все мРНК, но и ряд биологически важных некодирующих миРНК. Данные миРНК являются важным звеном в регуляторных сетях на уровне РНК, определяя экспрессию многих функциональных групп генов.

Разработка математической модели
В рамках разработки математической модели будет использован способ повышения достоверности классификации за счет метода отбора транскриптов [Галатенко, 2013], позволяющего снизить количество транскриптов благодаря оптимизации совокупной информативности результирующего набора вместо использования ранжирования по индивидуальной информативности. Следует отметить, что при этом для настройки классификатора будет использован более мощный по сравнению с традиционно используемыми центроидами [Tibshirani, 2002] аппарат SVM (метод опорных векторов, [Cortes, Vapnik, 1995].

Возможности обеспечить выбор глобально наиболее информативной совокупности мРНК методом полного перебора нет даже при использовании суперкомпьютерных технологий, однако есть возможность ослабления эвристик, используемых при оптимизации, что позволит построить диагностические и предиктивные тест-системы, предоставляющие более достоверную информацию для прогноза метастазирования РПЖ.

Ключевыми отличиями предлогаемого нами метода от существующих аналогов являются оптимизация совокупной информативности набора транскриптов вместо использования транскриптов с наибольшей индивидуальной информативностью, а также увеличении числа реализаций в методах типа Монте Карло, используемых при отборе набора транскриптов.

Для построения эффективных алгоритмов построения математической модели будут определены функционалы, формализующие понятие совокупной информативности набора транскриптов, предложены подходы к их оптимизации, а также проанализированы возможные методы машинного обучения, которые будут использоваться для построения классификаторов. Кроме этого, будет разработан аппарат для сопоставления эффективности (достоверности) математической модели с общим назначением.

Предполагается изучить возможность эффективного применения как различных модификаций так называемых жадных алгоритмов (в частности, возвратных жадных алгоритмов, а также жадных алгоритмов с неединичной глубиной шага – см., в частности, [Лившиц, 2006], так и направленных на построение редких представлений (sparse representations) методов l1-минимизации [Donoho, Elad, 2003]. Спектр методов машинного обучения, который планируется рассмотреть, включает, помимо метода опорных векторов [Галатенко, 2013] и логистической регрессии [Hosmer, Lemeshow, 2004], методы кластерного анализа [Мандель, 1988], решающих деревьев [Breiman et al., 1984], а также некоторые генетичские подходы к оптимизации [Bies et al., 2006].

Разработка реагентов
При разработке реагентов для определения экспрессии генов, вошедших в математическую модель, методом количественной ПЦР особое внимание будет уделено выбору генов для нормирования данных. Необходимость выбора условий нормирования данных является общей проблемой для всех методов, оценивающих уровень экспрессии генов. В случае ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), ставшего de facto стандартным методом анализа экспрессии генов, этот вопрос особенно актуален. При проведении подобных экспериментов необходимо быть уверенными, что наблюдаемые изменения обусловлены истинно биологическими причинами, а не случайной погрешностью, связанной с различиями в способе забора и начального количества материала, особенностями проведения обратной транскрипции, используемым прибором для детекции и др. В настоящее время концепция использования референсных генов в качестве внутреннего контроля является общепризнанной. До 1999 г. 90% анализов экспрессии генов было выполнено с нормировкой только на один ген. Постепенно мировое сообщество приняло необходимость нормировки на несколько референсных генов. Идеальный референсный ген должен экспрессироваться на стабильном уровне во всех тканях и типах клеток на любой стадии их развития и независимо от экспериментальных условий. Поскольку таких генов не существует, стабильность экспрессии каждого потенциального референсного гена необходимо подтверждать для конкретной выбранной модели до начала исследований.

Реагенты для проведения полимеразной цепной рекции в режиме реального времени будут разрабатываться в учетом особенностей программируемых ДНК-амплификаторов отечественного производства.

Решение поставленных задач позволит изучить роль интегрина бета 4 в патогенезе рака предстательной железы, выявить новые прогностические маркеры рака предстательной железы и разработать реагенты для их определения, а также будет способствовать развитию сотрудничества Институтом анатомии и экспериментальной морфологии Университетского медицинского центра Гамбург-Эппендорф (Гамбург, ФРГ) по приоритетному направлению федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно- технологического комплекса России на 2014-2020 годы» – науки о жизни.

Список использованной литературы:
В.В. Галатенко и др. (2013) О построении медицинских тест-систем с использованием жадного алгоритма и метода опорных векторов // БЭБиМ, 156 (11), 654-658.
R. Tibshirani et al. (2002) Diagnosis of multiple cancer types by shrunken centroidsof gene expression // Proc. Natl. Acad. Sci USA, 99 (10): 6567-6572.
C. Cortes, V. Vapnik (1995) Support-vector networks // Machine Learning, 20 (3): 273-297.
Е.Д. Лившиц (2006) О Возвратном жадном алгоритме // Изв. РАН, Сер. Матем, 70 (1), 95-116.
D.L. Donoho, M. Elad (2003) Optimally sparse representation in general (nonorthogonal) dictionaries via l1 minimization // PNAS, 100 (5), 2197–2202.
D.W. Hosmer, S. Lemeshow (2004) Applied Logistic Regression.
И.Д. Мандель (1988) Кластерный анализ.
L. Breiman et al. (1984) Classification and Regression Trees.
R.R. Bies et al. (2006) A Genetic Algorithm-Based, Hybrid Machine Learning Approach to Model Selection. // J Pharmacokinet Pharmacodyn, 33(2) :195-221.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Основными Научно-техническими результатами ПНИ будут:
результаты теоритических изысканий;
результаты патентных исследований;
математическая модель, позволяющая прогнозировать метастазирование рака предстательной железы.
набора реагентов для оценки уровня мРНК в биопсийном материале.
проект технического задания на проведение ОКР «Разработка многопараметрической диагностической тест-системы для прогноза метастазирования рака предстательной железы».
Результаты ПНИ предназначены для применения в лабораторной диагностике рака предстательной железы (РПЖ).
Потенциальными целевыми потребителями ожидаемых результатов ПНИ являются:
1) Профильные онкологические медицинские научные учреждения;
2) Частные организации, уполномоченные оказывать лабораторные услуги населению.
Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр «БиоКлиникум», г. Москва. Лаборатория «БиоКлиникум» с 2011 года является бизнес-партнером Заявителя и обеспечивает коммерциализацию его основных научно-технических результатов. В частности, осуществляет производство и реализацию диагностических тест-систем для определения индивидуального прогноза эффективности химиотерпии рака молочной железы (Регистрационное удостоверение No РЗН 2014/1803). Кроме того, в настоящее время индустриальный партнер по проекту организует производственно-испытательный центр на базе чистых помещений, спроектированных в соответствии с ИСО 7. Центр будет запущен в эксплуатацию в 2015 году.

Текущие результаты проекта:
Выполнен обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы в области научно-технической проблемы, исследуемой в рамках ПНИ. Проведены патентные исследования. Осуществлено исследование биологических образцов методами мультиплексного параллельного анализа нуклеиновых кислот на микрочипах высокой плотности для выбора наиболее информативных биомаркеров и разработки математической модели. Разработана математическая модель. Разработаны реагенты для определения экспрессии генов методом количественной ПЦР. Разработана программа и методика испытаний экспериментальных образцов реагентов для определения экспрессии генов методом количественной ПЦР. Проведены испытания реагентов для определения экспрессии генов методом количественной ПЦР. Осуществлена оценка полноты решения задачи и достижения поставленных целей ПНИ. Разработан проект технического задания на проведение ОКР: «Разработка многопараметрической диагностической тест-системы для прогноза метастазирования рака предстательной железы». Разработаны рекомендаций по реализации результатов ПНИ в реальных секторах экономики.