Регистрация / Вход
Прислать материал

Создание макета функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа PARP1

Докладчик: Малюченко Наталия Валериевна

Должность: доцент, кбн, доцент

Цель проекта:
1 Цели выполнения ПНИ 1.1. Разработка новых методических подходов для исследований транскрипционного фактора PARP1, являющегося мишенью действия противоопухолевых препаратов. 1.2. Предоставление научно-исследовательским организациям новых и эффективных методов и средств проведения исследований в области изучения механизмов транскрипции и, в частности, транскрипционных факторов, задействованных в механизмах канцерогенеза. 1.3. Получение значимых научных результатов по механизму действия PARP1 при транскрипции хроматина, позволяющих переходить к созданию новых видов научно-технической продукции (функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов, ингибирующих активность PARP1). 1.4. Создание обобщенной модели действия PARP1 методами компьютерного моделирования на основе полученных экспериментальных данных и на основе систематизации научно-технической литературы. 1.5. Получение макета функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1

Основные планируемые результаты проекта:
Основные планируемые результаты ПНИ - получение экспериментальных образцов и макета системы анализа PARP1 и проведение в них тестовых экспериментов по оценке действия потенциальных лекарственных веществ, направленных на PARP1.
Основные характеристики планируемых результатов. Будет получен набор экспериментальных образцов системы скрининга ингибиторов PARP1 на основе нуклеосомной системы транскрипции in vitro. Будет осуществлен подбор оптимальных функциональных транскрипционных тестов для проверки активности PARP1 на основе биохимического и флуоресцентного анализа. Будут получены клеточные линии, стабильно продуцирующие рекомбинантный PARP1; наработан и очищен рекомбинантный белок PARP1 человека и дрожжей. Будут функционализированы экспериментальные образцы нуклеосомных систем транскрипции введением белка PARP1. Будут проведены тестовые испытания экспериментальных PARP1-функционализированных систем с помощью биохимических и флуоресцентных методов, разработаны количественные методы оценки аналитов в экспериментальных образцах, в том числе определение констант скоростей. Для экспериментов по ингибирующей активности PARP1 будут отобраны: 1) конкурирующие за связывание с НАД+, соединения (ингибиторы PARP1 третьего поколения), 2) разрушающие взаимодействие PARP1 с ДНК (Hoechst33342 и цисплатиновые производные), 3) разрушающие взаимодействие PARP1 с гистонами (FACT и др.). Будут проведены тестовые эксперименты по оценке действия ингибиторов PARP1 разных классов в экспериментальных образцах. Будет проведена доработка и усовершенствование экспериментальных образцов по результатам экспериментальных исследований. Будет проведена разработка программы и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов, включая разработку стандартных операционных процедур. Будет проведена разработка лабораторного технологического регламента изготовления экспериментальных образцов. Будут изготовлен макет функциональной системы
скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1 соединения, модулирующие активность PARP1. Будут проведены испытания разработанного макета функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1. Будет проведена оценка аналитической достоверности и диагностической информативности макета функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Выполнение проекта создаст необходимый научный и технологический задел для получения коммерческой
системы поиска и функциональной проверки новых противоопухолевых лекарственных препаратов,
направленных на PARP1. Получение лекарств – долгий и дорогостоящий процесс, при этом наблюдается
печальная статистика: из 5–10 тысяч соединений лишь 0,1% доходит до стадии клинических испытаний, в
результате которых только 10–20% разрешают к применению. Большинство молекул отсеивается на
стадии преклинических исследований по показателям эффективности и безопасности. Доклинические
эксперименты (на культурах клеток, тем более животных моделях) являются высокозатратными,
трудоемкими и длительными. Создаваемая в проекте система является миниатюрной функциональной
системой, воспроизводящей клеточный процесс транскрипции. Учитывая, что система собирается из
«человеческих» белков и нуклеиновых кислот, то в ней воспроизводятся процессы, характерные для
человеческой клетки. Данная система позволяет проверять активность соединений, играющих роль в
процессе транскрипции и отбирать наиболее функционально активные. Таким образом, использование
данной системы позволяет миновать стадию «отсева» молекул, которую традиционно проводят на
клеточных культурах. Что в значительной степени удешевляет и убыстряет процесс поиска новых
лекарственных соединений. Особо стоит отметить, что систему можно функционализировать введением
молекулярных мишеней и отбирать в ней соединения, имеющие четкую направленность на мишень. В
данном проекте предлагается функционализировать PARP1 как перспективной противоопухолевой
мишенью для действия противоопухолевых лекарств. Кроме того, разработки такой системы перспективны
и для получения лекарств для терапии сердечно-сосудистых, воспалительных, нейродегенеративных
заболеваний, а также влияющих на процесс старения клетки. В целом, проводимые исследования
необходимы для дальнейшего развития фармацевтической и биотехнологической промышленности в
России, а также для разработки новых методов и подходов в терапии социально значимых заболеваний.

Текущие результаты проекта:
Проведен анализ научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов по теме исследований. Подробно в обзоре описаны механизмы и ферменты поли-АДФ-рибозилирования. Особое внимание уделено ферменту PARP1. Проанализировано его строение, каталитическая, ДНК-связывающая активность, репарационная и транскрипционная активность PARP1, механизмы регуляции активностями PARP1. Детально рассмотрено вовлечение PARP1 в процесс канцерогенеза и перспективы использования ингибиторов PARP1 в противо-опухолевой терапии. Подробно описаны три поколения ингибиторов PARP1 и исследование их терапевтического потенциала на примере проведения до-клинических и клинических испытаний. Проведены патентные исследования в соответствии с требованиями ГОСТ 15.011-96. Подробный анализ патентной документации и научно-технической литературы свидетельствует о том, что существует значительный интерес ученых к поиску новых противоопухолевых соединений, к которым относятся ингибиторы фактора PARP1. При этом практически отсутствуют охранные документы, посвященные теме скрининговых систем для отбора ингибиторов PARP1. Что в целом, создает благоприятные условия для патентования изобретений в области получения бесклеточной функциональной системы скринига новых противоопухолевых лекарств – ингибиторов FACT. Представлено обоснование выбора методов и средств, направлений исследований и способов решения поставленных задач. Проведена сравнительная оценки вариантов возможных решений исследуемой проблемы. Осуществлен подбор и разработка биохимических методов идентификации и определения структур ключевых интермедиатов, формирующихся в присутствии PARP1, в том числе адаптированы для целей проекта такие методы, как электрофорез в нативных условиях, электрофорез в денатурирующих условиях, футпринтинг ДНКазой1 и гидроксильный, рестрикционный анализ, методики оценки количественных параметров. Проведен дизайн для создания матриц функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа PARP1. Осуществлен подбор оптимальных функциональных транскрипционных тестов для проверки активности PARP1 на основе биохимического анализа. В частности, функциональный тест для проверки эффективности транскрипции, тест с ограниченной транскрипцией, тест на определение констант скоростей. Проведены теоретические исследования отдельных факторов влияющих на качество функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа PARP1. Проведены необходимые мероприятия по достижению заданных значений программных индикаторов.