Регистрация / Вход
Прислать материал

Получение штаммов-продуцентов сульфидов металлов из кислых отходов добычи полиметаллических руд на основе метагеномного анализа.

Докладчик: Карначук Ольга Викторовна

Должность: профессор, зав. лаб., профессор

Цель проекта:
1. Основной задачей проекта является поиск и выделение новых штаммов-продуцентов и/или консорциумов ацидофильных/ацидотолерантных сульфидогенных микроорганизмов с использованием данных метагеномного анализа. В ходе выполнения проекта должны быть решены следующие подзадачи: - Для эффективного выделения ацидофильных штаммов получить и проанализировать данные метагенома кислых местообитаний отходов добычи сульфидных руд; -Выделить новые сульфидогенные штаммы/консорциумы микроорганизмов активные при низких значениях рН (не выше 2.5) и высоких концентрациях металлов; -Секвенировать полные геномы новых штаммов и на их основе определить механизмы устойчивости к низким рН и металлам; -Разработать научный задел в виде ростовых характеристик ацидофильных/ацидотолерантных штаммов сульфидогенов, химических и минералогических характеристик образуемых штаммами сульфидов металлов и геномной информации, который должен послужить основой для последующего создания ОКР по разработке биотехнологии извлечения металлов из отходов горнодобывающей и металлообрабатывающей промышленности и ОТР по созданию соответствующих биореакторов. 2. Цель проекта - разработать биотехнологический метод извлечения металлов из отходов горнодобывающей промышленности, основанный на штаммах-продуцентах или консорциумах ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов устойчивых к металлам; а также получить ацидофильные/ацидотолерантные штаммы-продуценты и/или консорциумы сульфидогенных микроорганизмов из кислых отходов добычи сульфидов металлов с использованием данных о метагеномах местообитаний этих отходов.

Основные планируемые результаты проекта:
В ходе реализации проекта предполагается получить следующие результаты:
-Получение проб кислых отходов добычи и обогащения полиметаллических сульфидных руд и проведение их метагеномного анализа.
-Получение консорциумов и чистых культур сульфидогенных штаммов-продуцентов, устойчивых к кислой среде с рН не выше 2.5 и общей концентрации растворенных металлов не менее 500 мг/л.
-Анализ последовательностей полных геномов новых сульфидогенных штаммов-продуцентов и определение основных возможных генетических механизмов устойчивости к ионам металлов и высокой концентрации протонов.
-Определение оптимальных условий культивирования новых штаммов сульфидогенов в лабораторных условиях, включая значения рН, температурные условия, ростовые субстраты, а также выявление условия для максимальной продукции биомассы и сероводорода – основного действующего агента при осаждении металлов.
-Определение максимальных концентраций ионов меди и других металлов, позволяющих рост новых ацидофильных сульфидогенов.
-Изучение химических и минералогических характеристик образуемых штаммами сульфидов металлов
-Разработка лабораторного регламента по культивированию штаммов перспективных для биотехнологий извлечения металлов из шахтных вод и технических требований к использованию биотехнологий для извлечения металлов из отходов горнодобывающей промышленности.
Добыча и производство металлов (медь, никель, кобальт, цинк) из сульфидных руд сопровождается образованием значительного количества отходов. Прежде всего, это отходы обогащения руды после флотации, представляющие мелкую фракцию, смешанную с водной фазой, размещаемую в хвостохранилищах. Мелкий размер частиц сульфидсодержащей породы приводит к развитию процессов интенсивного окисления металлов, сопровождающихся выделением протонов и резким понижением рН среды. Другим источником металлов являются сточные воды металобрабатывающих и гальванических производств, а также воды естественного происхождения из отвалов предприятий горнодобывающей промышленности, содержащие высокую концентрацию ионов металлов. Такие воды - фактически "бесплатное" сырье, к тому же опасный загрязнитель окружающей среды. Предлагаемый проект решает сразу две задачи: (1) извлечение ценного продукта – металлов и (2) очистка от них отходов предприятий.
Биогенное извлечение металлов имеет ряд существенных преимуществ перед химическими технологиями осаждения. В частности, осаждение сульфидов более эффективно в присутствии комплексных соединений и хелаторов по сравнению с гидроксидами металлов (продуктами обработки отходив известью для снижения их токсичности, традиционно применяемой на горно-обогатительных комбинатах); сульфиды металлов образуют более компактный осадок, и этот осадок легче обезвоживается; высокая реакционноспособность сероводорода способствует быстрому осаждению сульфидов с очень низкой растворимостью в области широкого диапазона рН; возможно селективное осаждение металлов в нерастворимые сульфиды.
В настоящее время голландская компания Paques (http://en.paques.nl /pageid=49/Metal_and_Mining.html) является мировым лидером в создании биотехнологий осаждения металлов под действием сульфидогенных микроорганизмов. Существенными недостатками технологий Paques является использование чувствительных к металлам и кислой реакции среды смешанных культур микроорганизмов, вследствие чего процесс является двустадийным и реализуется в двух биореакторах: получение сероводорода на первой стадии и образование сульфидов металлов в химической реакции с сероводородом на второй стадии. Получение ацидофильных/ ацидотолерантных штаммов-продуцентов, устойчивых к металлам и повышенной концентрации протонов, позволит создать одностадийный однореакторный процесс вместо двухстадийного у Paques, что и определяет новизну разрабатываемой биотехнологии. Введение одностадийного процесса позволит снизить себестоимость, улучшить извлечение металлов за счет прямого контакта металлов с сайтами нуклеации на клеточной стенке микроорганизмов. На основе экстремофильных сульфидогенов возможно получение в качестве конечного продукта сульфидов известного химического и минералогического состава вместо аморфных сульфидов переменного состава, получаемых Paques.
Выделение ацидофильных/ацидотолерантных сульфатредуцирующих прокариот (СРП) до сих пор не имело большого успеха, несмотря на многочисленные свидетельства протекания процесса в кислых местообитаниях. К настоящему времени в литературе описано 3 ацидофильных культуры СРП. Очевидно, что процесс выделения ацидофильных/ацидотолерантных изолятов представляет серьезное препятствие для разработки биотехнологий осаждения сульфидов металлов. Преимущества предлагаемого нами подхода заключаются в использовании данных метагеномного анализа при выделении штаммов-продуцентов сульфидов металлов. Предполагаемые сульфидогены будут первоначально найдены в коллективном метагеноме, полученном для местообитаний из отходов горнодобывающей промышленности. Также анализ метагенома позволит предположить возможные ростовые субстраты для выделения культур путем анализа существующих в экосистеме метаболических путей. Секвенирование и анализ метагенома будет проведен соисполнителем проекта, Центром «Биоинженерия» РАН.
Отбор проб для выделения СРП будет проведен одновременно с выделением ДНК для метагеномного анализа. В качестве объекта для выделения ацидофильных/ацидотолерантных изолятов мы планируем использовать отходы добычи полисульфидных руд месторождения Шерловая Гора в Забайкальском крае. Добыча различных металлов (олово, серебро, медь) велась на этом месторождении более ста лет. В результате большая территория на месторождении занята различными отходами, включая хвостохранилища после флотации руд. Наши предварительные исследования показали, что высачивания хвостохранилищ содержат экстремально высокую концентрацию меди, никеля, кадмия, урана и других металлов и характеризуются низкими рН.
При отборе проб будет проведен мониторинг физико-химических параметров различных типов отходов добычи металлов (высачивания воды в хвостохраниалищах и отвалах, осадки хвостохранилищ). Одновременно с отбором проб для метагеномного анализа и установления накопительных культур будет проведено измерение активности сульфидогенной микрофлоры непосредственно в отходах с использованием радиоактивно-меченного сульфата. Будут использованы методы, разработанные нами для кислых шахтных отходов при оценке интенсивности бактериальной сульфатредукции в экосистемах Норильской индустриальной зоны (Karnacnuk et al., 2005). Для выращивания СРП в присутствии повышенных концентраций ионов металлов и низких рН будут использованы методические приемы, ранее разработанные нашей научной группой (Karnachuk et al., 2003; Karnachuk et al., 2008).
Мониторинг накопительных культур будет проводиться методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях (ДГГЭ). Результаты ДГГЭ будут сопоставлены с нахождением целевых филотипов в метагеноме. ДГГЭ-анализ будет использован на каждой стадии выделения чистых культур. Для выделенных чистых культур будет проведено определение параметров роста (возможные доноры и акцепторы электронов, пределы и оптимальные значения рН, максимальные концентрации металлов, позволяющие рост). Генетическая характеристика штаммов будет проведена путем секвенирования полных геномов. Секвенирование и анализ геномов будет проведен соисполнителем проекта, Центром «Биоинженерия» РАН. Получение последовательностей геномов позволит провести анализ механизмов устойчивости штаммов-продуцентов к металлам и низким рН среды. Для поиска родственных геномов, выравнивания и сортировки контигов будут использованы он-лайн сервисы BLAST, программы Mauve (Darling et al., 2010), r2cat (Husemann and Stoye, 2010) и Gepard (Krumsiek et al., 2007). Первоначальная автоматическая аннотация будет проведена с использованием пакета программ myRAST (Aziz et al., 2008). Визуализация структуры молекулы будет проведена в графических пакетах DNAPlotter (Carver et al., 2009) и GeneWiz browser (Hallin et al. 2009). Дополнительный поиск нуклеотидных/аминокислотных последовательностей транспорта и устойчивости будет проведен внутри гипотетических протеинов полученных после автоматической аннотации на основе анализа наличия соответствующих консервативных мотивов и доменов. Для поиска консервативных доменов и мотивов будет использован инструмент MEGA5.
Состав сульфидов металлов, образуемых в экспериментах с чистыми культурами ацидофильных/ацидотолератных СРП и сульфидогенными консорциумами, будет проанализирован с помощью современных методов материаловедческого анализа. Для характеристики сульфидов металлов будут использованы методы, позволяющие выполнить комплексное описание, включая пространственную характеристику, кристаллическую структуру и элементный анализ сульфидов. Первоначально осадки сульфидов металлов будут собраны центрифугированием или фильтрованием по разработанным ранее в нашей группе методикам (Karnachuk et al., 2008; Ikkert et al., 2013). Образование сульфидов будет изучено на тонких срезах клеток с использованием трансмиссионной электронной микроскопии (TEM). Одновременно будут получены и расшифрованы дифракционные картины кристаллических сульфидов (XRD) и проведен анализ осадков с использованием сканирующей электронной микроскопии, совмещенной в энергодисперсионным анализом (SEM-EDS). Материаловедческий анализ будет проведен на базе материаловедческого центра коллективного пользования при ТГУ.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Выделение новых ацидофильных/ацидотолерантных штаммов-продуцентов сульфидов металлов и их генетическая, физиологическая и биотехнологическая характеристика позволит разработать научно-технический задел для создания новых технологий рециклирования металлов из отходов горнодобывающей промышленности. В качестве субстрата в новых технологиях могут быть использованы сточные воды предприятий по переработке цветных металлов, кислые шахтные дренажные воды, образующиеся на территории хранилищ отходов добычи сульфидных руд, отходы обогащения и пирометаллургии сульфидных руд, стоки гальванических производств и т.д.
Результаты исследований по определению оптимальных условий для наиболее эффективного получения кристаллических осадков сульфидов металлов на основе использования полученных штаммов-продуцентов могут быть использованы для постановки ОКР по повторному извлечению металлов из отработанных руд.
Основным производителем биотехнологий извлечения металлов из отходов зарубежом является компания Paques (Нидерланды). Например, на пилотной установке по технологии THIOPAQ, поставляемой Paques, в Budel Zink (Нидерланды) производится около 10 тонн сульфида цинка в день, что соответствует годовому объему производства около 7 млн. долларов с одной установки. Аналогичные предприятия есть в США, Австралии, Канаде.
Потенциальными потребителями биотехнологий могут быть предприятия горнодобывающей промышленности; заводы по переработке руд цветных металлов; предприятия, занимающимися производством и эксплуатацией очистных сооружений; биотехнологические компании. Результаты проекта могут быть использованы ГМК «Норильский никель», Кольской горно-металлургической компанией, Уральской горно-металлургической компанией, компанией Полюс Голд и другими Российскими и международными компаниями, участвующими в добыче, обогащении, производстве и переработке металлов.
Мы предполагаем, что непосредственными индустриальными партнерами для создания технологий, основанных на ацидофильных штаммах-продуцентах, будут биотехнологические компании, занимающиеся производством биологических препаратов. В частности, компания «Экойл», специализирующаяся на производстве и поставках микробных препаратов для очистки нефтяных разливов, выразила интерес и готовность сотрудничать в области создания новых биотехнологических схем для извлечения металлов.
Результаты ПНИ будут использованы в образовательном процессе в ТГУ. Будут разработаны новые модули для лекционных курсов «Введение в биотехнологию», «Биотехнология», «Экологическая микробиология», «Экологическая биохимия», «Загрязнение водных экосистем» и большом практикуме студентов, специализирующихся в области биотехнологии, микробиологии и экологии. Студенты ТГУ примут участие в выполнении ПНИ и используют полученные результаты в курсовых и дипломных работах, магистерских и кандидатских диссертациях по специальности «биология».

Текущие результаты проекта:
1. Подготовлен аналитический обзор информационных источников
2. Разработан план исследований, направленный на проведение метагеномного анализа сообщества микроорганизмов шахтных вод, содержащих отходы добычи сульфидных руд и характеризующихся низкими значениями рН и высокими концентрациями ионов металлов
3. Проведен отбор проб воды и осадков хвостохранилищ сульфидных руд «Бом-Горхон» и «Шерловая гора», Забайкальский край
4. Определены физико-химические параметры (рН, Eh, температура) воды и осадков хвостохранилищ, которые использовались для метагеномной характеристики и получения штаммов и/или консорциумов ацидофильных сульфидогенных ацидофильных микроорганизмов
5. Определены концентрации ионов металлов в воде методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-MS)
6. Для некоторых проб осадков хвостохранилищ изучен элементный состав методом энерго-дисперсионного анализа с помощью сканирующей электронной микроскопии и проведен минералогический анализ твердых осадков.
7. Проведены работы по выделению метагеномной ДНК сообщества микроорганизмов из воды и осадков хвостохранилищ добычи сульфидных руд с низкими значениями рН и высокими концентрациями металлов
8. Получены консорциумы ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов, растущих анаэробно при низких начальных значениях рН на различных органических субстратах