Регистрация / Вход
Прислать материал

Клонирование, выделение и изучение свойств новых бактериальных ДНК-метилтрансфераз M.AgsI, M.AluBI и M.FatI, узнающих и уникально модифицирующих последовательности ДНК TTSAA, AGCT и CATG, соответственно

Докладчик: Дедков Владимир Сергеевич

Должность: старший научный сотрудник, старший научный сотрудник ООО "СибЭнзайм"

Цель проекта:
Цели ПНИ: 1.1 Создание методами биоинженерии трех штаммов-суперпродуцентов новых бактериальных ДНК- метилтрансфераз - M.AgsI, M.AluBI и M.FatI, не имеющих аналогов, и востребованных для создания метилированных ДНК-субстратов в молекулярно-биологических исследованиях и современных технологиях эпигенетики. 1.2 Исследования полученных генетических конструкций, технологических характеристик штаммов- суперпродуцентов, получение и определение специфичности метилирования рекомбинантных ДНК– метилтрансфераз. Цели проекта: Расширение ферментной базы для биологии и медицины: - создание методами биоинженерии трех штаммов-суперпродуцентов новых прототипов бактериальных ДНК-метилтрансфераз - M.AgsI, M.AluBI и M.FatI, не имеющих аналогов, и востребованных для создания метилированных ДНК-субстратов в молекулярно-биологических исследованиях и современных технологиях эпигенетики; - исследования полученных генетических конструкций, технологических характеристик штаммов-суперпродуцентов, получение препаратов новых ферментов и определение специфичности метилирования продуцируемых рекомбинантных ДНК–метилтрансфераз.

Основные планируемые результаты проекта:
Задачи ПНИ и возможные пути их решения
1. Создание геномных библиотек Agrococcus species 25, Arthrobacter luteus B и Flavobacterium aquatile для
последующего выделения из них рекомбинантных плазмид, содержащих гены ДНК-метилтрансфераз
M.AgsI, M.AluBI и M.FatI с помощью отбора плазмид, не гидролизующихся соответствующими
рестриктазами (AgsI, AluBI и FatI).
2. На основе отобранных рекомбинантных плазмид, несущих гены ДНК-метилтрансфераз M.AgsI, M.AluBI
и M.FatI, получение рекомбинантных штаммов-продуцентов соответствующих ферментов.
3. Оптимизация технологии выращивания штаммов-продуцентов и хроматографического выделения из них
препаратов ферментов.
4. Изучение значимых для практики биохимических свойств ДНК-метилтрансфераз M.AgsI, M.AluBI и
M.FatI. Анализ их сайт-специфичности, типа метилирования оснований.
5. Анализ структур генов ДНК-метилтрансфераз M.AgsI, M.AluBI и M.FatI и кодируемых ими
аминокислотных последовательностей.

Ожидаемые результаты
1. Должен быть проведён аналитический обзор литературы по теме: «Бактериальные ДНК–
метилтрансферазы и чувствительность к метилированию различных ДНК-эндонуклеаз», (не менее 15
информационных источников за 2009-2014 гг).
В данном обзоре будут проанализированы основные способы клонирования генов ДНК-метилтрансфераз;
разнообразие существующих ферментов; основные проблемы, возникающие в связи с анализом сайт-
специфичности ферментов; методологические подходы к анализу чувствительности к метилированию ДНК
для разных типов ДНК-эндонуклеаз.
2 Проведённые патентные исследования должны показать научную новизну и практическую значимость
данного проекта, а также ожидаемую патентную чистоту при последующем оформлении патента на новый
штамм-продуцент ДНК-метилтрансферазы M.AgsI.
3. Должно быть проведено обоснование способов решения задач по получению рекомбинантных штаммов-
продуцентов новых ферментов. Должно быть проведено сравнение различных методов клонирования и
выбран оптимальный метод.
4. Должны быть получены геномные библиотеки для диких штаммов-продуцентов новых ферментов, из
которых будут отобраны только те рекомбинантные плазмиды, которые содержат гены соответствующих
метилаз.
5. Должна быть определена первичная структура генов всех трёх ДНК-метилтрансфераз. Анализ
первичной структуры генов и соответствующих белков должен позволить уточнить тип метилируемого
основания ДНК.
6. Должны быть разработаны Программы и методики исследовательских испытаний экспериментальных
образцов – биомассы штаммов-продуцентов трёх ДНК-метилтрансфераз и препаратов ферментов,
выделенных из них.
7. Должны быть получены экспериментальные образцы – биомассы штаммов-продуцентов ДНК-
метилтрансфераз (не менее 100 г), из которых должны быть получены другие экспериментальные образцы
– препараты соответствующих ферментов (не менее 5 мл каждый). По результатам проведенных
исследовательских испытаний должны быть оформлены соответствующие акты и протоколы.
8. Должны быть опубликованы 3 статьи, индексируемые в в базе данных Scopus или в базе данных "Сеть
науки" (WEB of Science).
9. Должны быть изучены биохимические свойства ДНК-метилтрансфераз, в том числе сайт-
специфичность. Должна быть продемонстрирована возможность получения сайт-специфического
гидролиза с помощью хотя бы одной из ДНК-метилтрансферазы и метилзависимой ДНК-эндонуклеазы по
уникальным сайтам.
10. Все три штамма-продуцента должны быть депонированы во Всероссийской коллекции промышленных
микроорганизмов (ВКПМ).
9. Первичная структура трёх полученных в ходе выполнения ПНИ рекомбинантных плазмид должна быть
депонирована в базе данных GenBank.
10. Должны быть разработаны аналитические паспорта на препараты ДНК-метилтрансфераз M.AgsI,
M.AluBI и M.FatI.
11. Должны быть наработаны биомассы отобранных рекомбинантных штаммов-продуцентов ДНК-
метилтрансфераз в усреднённых условиях культивирования. Из биомасс должны быть выделены
препараты ДНК-метилтрансфераз, для которых будут уточнены биохимические свойства ферментов
(включая модифицируемое основание и оптимальные условия работы).
12. Должно быть проведено секвенирование участков геномов, встроенных в рекомбинантные плазмиды
для всех трёх штаммов-продуцентов. Будет проведён биоинформационный анализ полученных
последовательностей с гомологичными последовательностями в геномах других бактерий, структуры
которых приведены в доступных базах данных.
13. Первичные структуры полученных плазмид должны быть депонированы в базе данных GenBank.
14. Должны быть разработаны проекты технического задания на проведение ОКР по темам: «Организация
промышленного производства рекомбинантной ДНК-метилтрансферазы M.AgsI», «Организация
промышленного производства рекомбинантной ДНК-метилтрансферазы M.FatI», «Организация
промышленного производства рекомбинантной ДНК-метилтрансферазы M.AluBI».
15. Должна быть оформлена техническая документация на производство трёх препаратов ферментов
(M.AgsI, M.AluBI и M.FatI) в составе:
15.1 Лабораторный регламент получения целевых продуктов, оформленный в
соответствии с ОСТ 64-02-003-2002.
15.2 Эскизная конструкторская документация на экспериментальные образцы товарной формы
ферментных препаратов M.AgsI, M.AluBI и M.FatI, включающая чертеж и спецификацию.
15.3 Проект технических условий на товарные формы ферментных препаратов M.AgsI, M.AluBI и M.FatI.
16. Должны быть оформлены рекомендации и предложения по использованию результатов ПНИ в
реальном секторе экономики.
17. Должна быть оформлена отчетная документация в соответствии с требованиями технического задания
и актов Заказчика.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Области применения, способы использования результатов
Практическое применение ДНК-метилтрансфераз завязано на исследовании процессов, связанных с
тканевой дифференцировкой, онкологией и другими эпигенетическими изменениями. В случае, если по
результатам данного ПНИ окажется, что хотя бы одна из ДНК-метилтрансфераз метилирует цитозин в
положении С5, данный фермент может служить инструментом для разработки систем онкодиагностики.
Метилирование геномной ДНК по тем или иным сайтам приводит к изменению картины сайт-
специфического гидролиза ДНК-эндонуклеазами разных типов (эндонуклеаз рестрикции и
метилзависимых ДНК-эндонуклеаз), а значит, может лежать в основе новых технологий эпигеномного
секвенирования.
Конкурентным преимуществом новой ДНК-метилтрансферазы M.AgsI является то, что она модифицирует
новую последовательность ДНК, не узнаваемую всеми ранее известными ДНК-метилтрансферазами.
ДНК-метилтрансферазы M.AluBI и M.FatI, хотя и узнают последовательности, узнаваемые другими ДНК-
метилтрансферази, предположительно модифицируют их по другим основаниям и других позициях.
Данные ферменты, расширяют возможности для анализа чувствительности разных ДНК-эндонуклеаз, и
таким образом, будут служить инструментом для модификации сайт-специфического гидролиза ДНК. В
частности, совместное использование отдельных ДНК-метилтрансфераз, исследуемых в рамках проекта,
приведёт к созданию новых способов сайт-специфического гидролиза с помощью метилзависимых ДНК-
эндонуклеаз по новым последовательностям, которые нельзя расщепить более традиционными для
практики эндонуклеазами рестрикции.
Возможность модификации ДНК такого рода с помощью новых ферментов также служит инструментом
для изучения её роли в клетках (например, участии в процессах репликации бактериальных хромосом).
Созданные штаммы-продуценты будут использоваться в ООО «СибЭнзайм» (г. Новосибирск), где есть для
этого материально–производственная база, для производства препаратов ферментов.
Планируемое патентование нового штамма-продуцента AgsI обеспечит возможность лицензированного
производства препарата нового фермента и в других компаниях.

Текущие результаты проекта:
1. К настоящему времени созданы геномные библиотеки Agrococcus species 25, Arthrobacter luteus B и Flavobacterium aquatile. Из них выделены рекомбинантные плазмиды, содержащих гены ДНК-метилтрансфераз M.AgsI, M.AluBI и M.FatI с помощью отбора плазмид, не гидролизующихся соответствующими рестриктазами (AgsI, AluBI и FatI).
2. На основе отобранных рекомбинантных плазмид, несущих гены ДНК-метилтрансфераз M.AgsI, M.AluBI и M.FatI, получение рекомбинантных штаммов-продуцентов соответствующих ферментов.
3. Встроенные в плазмиды ДНК секвинированы и проанализированы. Определены аминокислотные последовательности ДНК-метилтрансфераз. M.AgsI и M.AluBI принадлежат к группам m6A и m4C ДНК–метилтрансферазам, у которых аминокислотные консервативные домены весьма сходны. M.FatI является m5C ДНК–метилтрансферазой.
4. Проведено выращивания штаммов-продуцентов и ведётся хроматографическое выделение из них препаратов ферментов для их дальнейшего изучения.