Регистрация / Вход
Прислать материал

Исследование молекулярных механизмов протекания процессов гибели иммуноцитов человека в условиях воздействия УФ-излучения и активных форм кислорода

Докладчик: Артюхов Валерий Григорьевич

Должность: Декан, профессор, Доктор биологических наук

Цель проекта:
Проект направлен на решение одной из центральных проблем современной медицинской биофизики -выявление закономерностей функционирования иммунокомпетентных клеток человека в норме, в условиях воздействия физико-химических факторов и при развитии патологических состояний организма человека. Конкретной задачей проекта является комплексное исследование молекулярных механизмов протекания процессов гибели иммуноцитов (лимфоцитов, нейтрофилов) человека в условиях воздействия УФ- излучения и активных форм кислорода. Целями выполнения работ являются: - реализация Программы развития Центра коллективного пользования научным оборудованием Воронежского государственного университета(далее – ЦКП) на 2014-2015 годы направленной на повышение эффективности участия центра в реализации перспективных междисциплинарных исследовательских проектов по приоритетным направлениям развития науки и технологий Российской Федерации, решений перспективных научных задач, в том числе в кооперации с ведущими мировыми научными и исследовательскими центрами; - повышение уровня сложности и расширения перечня выполняемых научно-технических услуг, а также развитие нормативно-методической, метрологической и информационной составляющих ЦКП.» - комплексное исследование молекулярных механизмов протекания процессов гибели иммуноцитов (лимфоцитов, нейтрофилов) человека в условиях воздействия УФ- излучения и активных форм кислорода. - анализ и обобщение представлений о механизмах регуляции апоптоза лимфоцитов человека в условиях воздействия физико-химических факторов (УФ- света, активных форм кислорода, монооксида углерода и азота). - изучение механизмов образования нейтрофильных внеклеточных ловушек в условиях воздействия УФ-света, активных форм кислорода, иммуномодуляторов.

Основные планируемые результаты проекта:
В результате выполнения ПНИ будут проведены анализ и обобщение представлений о механизмах регуляции апоптоза лимфоцитов человека и образования внеклеточных ловушек нейтрофилами в условиях воздействия физико-химических факторов (УФ- света, активных форм кислорода, монооксида углерода и азота). Будут изучены механизмы в условиях воздействия УФ-света, активных форм кислорода, иммуномодуляторов. Планируется создание компьютерных и математических моделей ключевых процессов реализации апоптоза иммуноцитов, что позволит прогнозировать и регулировать процессы функционирования иммунокомпетентных клеток в условиях воздействия физико-химических факторов и при развитии патологических состояний организма человека.
Планируется проведение исследований, направленных на выявление взаимосвязи различных путей реализации апоптоза (рецепторопосредованного, митохондриального, р53-зависимого) с изменениями функциональной активности теломеразы и длины теломерных участков хромосом в динамике развития процессов клеточной гибели иммуноцитов. Будет исследован прооксидантно- оксидантный статус лимфоцитов в условиях реализации апоптоза, индуцированного воздействием УФ- света и активных форм кислорода.
Будут созданы компьютерные и математические модели реализации различных путей апоптоза лимфоцитов человека в условиях воздействия УФ-света и АФК.
Будут исследованы процессы образования нейтрофильных внеклеточных ловушек в условиях воздействия различных физико-химических агентов. Будет изучено влияние УФ-излучения, активных форм кислорода (пероксид водорода, супероксидный анион радикал, гидроксильный радикал), монооксида азота и иммуномодуляторов (интерфероны) на процессы выхода ДНК из ядра нейтрофилов в условиях генерации нейтрофильных внеклеточных ловушек.
Планируется изучение механизмов влияния ряда физико-химических агентов (УФ-излучения, активных форм кислорода, иммуномодуляторов) на параметры реализации различных путей апоптоза (рецепторного каспазозависимого, митохондриального, р-53-зависимого) и цитолиза для выяснения их возможного участия в инициации и развитии процессов образования внеклеточных ловушек. Данные, полученные при исследовании фотоиндуцированных процессов в иммуноцитах, необходимы для выявления молекулярных механизмов лечебно-профилактического действия метода аутотрансфузии УФ- облучённой крови (АУФОК). Результаты исследований механизмов регуляции гибели иммунных клеток будут использованы для разработки способов регулирования программ жизнедеятельности иммуноцитов в условиях воздействия физико-химических факторов и при развитии патологических состояний организма человека, связанных с оксидативным стрессом (сердечно-сосудистых, воспалительных, нейродегенеративных и др.).

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Проведение предлагаемых нами исследований позволит развить и детализировать представления о способах инициации митохондриального пути апоптоза и роли митохондрий в реализации процессов клеточной гибели лимфоцитов в условиях воздействия физико-химических факторов. Полученные нами данные позволят выявить закономерности и механизмы тонкой регуляции функционирования иммунной системы человека в норме, при пато- и иммуногенезе, а также оценить возможности их регулирования с целью повышения эффективности лечения при проведении иммуноориентированной терапии в клинической практике.

Текущие результаты проекта:
Изучены изменения структурного состояния ДНК, уровня экспрессии мембранного F -рецептора, функциональной активности каспазы-3, концентрации Са2+, белков р53 и цитохрома с лимфоцитарных клеток человека в динамике развития апоптоза, индуцированного воздействием УФ-света (240-390 нм) в дозах 151, 1510, 3020 Дж/м2. Установлено, что УФ-свет индуцирует фрагментацию ДНК лимфоцитов после 20 ч инкубации модифицированных клеток. Показано, что в течение 1-5 ч после воздействия УФ-света на лимфоциты наблюдается повышение уровня экспрессии мембранных F -рецепторов смерти по сравнению с таковым для интактных клеток. Обнаружено увеличение функциональной активности каспазы-3 лимфоцитов через 8 и 24 ч и 6 и 8 ч после УФ-облучения клеток соответственно в дозах 151 и 1510 Дж/м2. С использованием метода ДНК-комет выявлено, что повреждения ДНК (однонитевые разрывы) появляются сразу после УФ-облучения лимфоцитов в дозах 1510 и 3020 Дж/м2 (кометы типа С1) и достигают максимума через 6 ч после модификации клеток (кометы типов С2 и С3). Установлено, что через 6 ч после воздействия УФ-света в дозах 1510 и 3020 Дж/м2 на лимфоциты происходит повышение уровня р53 в исследуемых клетках. Обнаружено, что УФ-облучение лимфоцитов в дозе 1510 Дж/м2 и их инкубация в течение 6 ч индуцируют значительный рост количества клеток, находящихся на поздней стадии апоптоза или некроза (66,3 %) по сравнению с таковым для контрольных образцов (1,6 %). При этом количество ранних апоптотических лимфоцитов возрастает с 7,9 % до 17,8 %. Сделано заключение о ведущей роли рецепторопосредованного (F -зависимого) каспазного и р53-зависимого путей в реализации апоптоза лимфоцитов, индуцированного воздействием УФ-света в дозах 151 и 1510 Дж/м2. Предложена схема возможных внутриклеточных событий, приводящих к апоптотической гибели лимфоцитов после их УФ-облучения. Анализ микроскопических препаратов показал, что 5 и 10 минут недостаточно для формирования ПМЯЛ внеклеточных ловушек. В связи с этим время инкубации было увеличено до 30 мин. Было установлено образование ловушек 80±2 % клеток. Облучение клеток проводили светом лампы ДРТ-400 в дозах 151, 453, 906 с использование светофильтра УФС-1 с полосой пропускания 240-390 нм. вызывает препаратов показал, что УФ-излучение в дозах 151, 453 и 906 Дж/м2 оказывает иммунодепрессивное действие на способность нейтрофилов образовывать НВЛ. При увеличении дозы облучения до 1359 Дж/м2 количество нейтровильных ловушек увеличивалось. Установлено повышение соотношения интенсивностей флуоресценции РНК к ДНК в сравнении с контролем во всех облучённых образцах. Показано, что при облучении в дозе 151 Дж/м2 соотношение интенсивностей свечения при 640 и 530 нм увеличивается в 3,0 раза по отношению к контролю, в дозе 453 Дж/м2 – в 1,5 раза, в дозе 906 Дж/м2 – в 0,3 раза, в дозе 1359 Дж/м2 – в 0,8 раз. Установлено, что размер фрагментов нуклеиновых кислот, образующих ловушки составляет около 10 000 п.н. и более. Методом ДНК-комет обнаружено, что при образовании нейтрофильных внеклеточных ловушек не происходит образования комет, отличных от типа С0 типа как в нативном состоянии, так и при облучении в дозах 151, 453, 906 и 1359 Дж/м2.