Регистрация / Вход
Прислать материал

Создание биокатализатора на основе новой рекомбинантной синтазы цефалоспоринов-кислот для синтеза цефалоспориновых антибиотиков

Докладчик: Эльдаров Михаил Анатольевич

Должность: в.н.с.

Цель проекта:
Цель проекта состоит в создании научно-технического задела и предпосылок для разработки эффективных, экономичных и экологически-чистых биокаталитических технологий получения субстанций цефалоспориновых антибиотиков класса цефалоспоринов-кислот, широко востребованных на российском и зарубежном рынках, но в настоящее время не производимых отечественными предприятиями фармацевтической промышленности. Более конкретно, проект направлен на создание технологического гетерогенного биокатализатора на основе фермента, специфичного к синтезу цефалоспоринов-кислот (Cephalosporin-acid synthetase, CASA), продуцируемого оригинальным штаммом Escherichia coli CZ-08 и разработке метода биокаталитического синтеза цефалоспоринов-кислот (на примере цефазолина).

Основные планируемые результаты проекта:
Реализация предлагаемого проекта позволит получить ряд новых научно-технических результатов, отличающихся несомненной новизной, актуальностью, патентоспособностью.
1. Будет расшифрована полноразмерная геномная последовательность штамма E.coli CZ-08 – продуцента CASA.
2. Будет идентифицирован новый ген CASA и проведено его сравнение с гомологичными генами пенициллинацилаз.
3. Будут созданы конструкции для экспрессии гена CASA и получены рекомбинантные штаммы E.coli - продуценты CASA для последующего использования в создании биокатализаторов.
4. Будут разработаны методы биосинтеза, выделения и иммобилизации CASA с целью создания гетерогенного технологического биокатализатора процессов синтеза цефалоспоринов-кислот.
5. Будет разработан и оптимизирован метод трансформации исходных субстратов в целевой антибиотик (на примере цефазолина) с использованием биокатализатора на основе рекомбинантной CASA.
6. Будет разработан проект Технических условий на технологический биокатализатор на основе рекомбинантной CASA в соответствии с ГОСТ 2.114-95;
7. Будет разработан проект Лабораторного технологического регламента процесса биокаталитического синтеза цефазолина в соответствии с ОСТ 64-02-003-2002;
8. Будет подготовлен проект технического задания на проведение прикладной НИР по теме: «Разработка метода получения субстанции цефазолина».

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Основная сфера применения результатов проекта - промышленная биотехнология, а именно, производство антибиотиков. Высокая стабильность и эффективность предполагаемых к созданию биокатализаторов, простота, удобство и экономичность процедур ферментативного синтеза цефазолина и других антибиотиков определяют перспективность создания на этой основе технологий промышленного получения антибиотиков класса цефалоспоринов-кислот при одновременном сокращении энергозатрат, трудоемкости технологических операций и пр., снижения экологической нагрузки при производстве за счет сокращения использования агрессивных химических агентов. Значимость реализуемого проекта определяется отсутствием у нас в стране не только биокаталитического, но и химического производства субстанций цефалоспопринов-кислот, притом, что в структуре потребления антибиотиков в России им принадлежит значительное место. Создание в России современного производства субстанций антибиотиков, в том числе β лактамных, является насущной задачей с точки зрения обеспечения биобезопасности страны и должно базироваться на современных экологически чистых биотехнологических процессах. Внедрение разрабатываемых технологий ферментативного синтеза антибиотиков на отечественных предприятиях фармацевтической промышленности позволит простимулировать производство готовых лекарственных форм и снизить зависимость отечественного лекарственного рынка от импортных субстанций и препаратов. Разработанные подходы по идентификации гена CASA, его экспрессии, созданию биокатализаторов для ферментативного синтеза других биологически-активных соединений для нужд пищевой, микробиологической и фармацевтической промышленности. Потребителями ожидаемых результатов могут являться научные, образовательные организации, предприятия фармацевтической и микробиологической промышленности. Одним из вариантов вовлечения результатов ПНИ в хозяйственный оборот непосредственно после завершения работ может быть коммерциализация объектов интеллектуальной собственности (продажа патентов и лицензий на использование разработанных ферментов, новых вариантов биокатализаторов, способов биосинтеза антибиотиков.

Текущие результаты проекта:
Расшифрована геномная последовательность штамма E.coli СZ-08 (ВКПМ В-10182) с использованием платформы пиросеквенирования Roche 454 GS FLX. Сравнение с известным геномом родительского штамма ATCC9637 выявило 32 инсерции/делеции и 1780 точковых замен, включающих 559 синонимических и 988 несинономических замен в белок-кодирующих генах, 233 мутации в некодирующих участках. Кодирующие и регуляторные районы гена пенициллин G ацилазы в двух штаммах идентичны, что указывает на то, что достигнутое в результате мутагенеза и селекции повышение в уровне ферментативной активности не является результатом мутаций в гене PGA, но, скорее всего, возникло вследствие инактивации неспецифических лактамаз и эстераз, атакующих ядро бета-лактамных антибиотиков, снижая выход продукта, либо в результате мутаций в каких-то действующих в транс-положении факторов. Сделан вывод, что ген CASA идентичен гену PGA. Вывод подтвержден результатами клонирования гена, его экспрессии, определения ферментативной активности в реакции синтеза цефазолина. Ген CASA (PGA) штамма CZ-08 выделен методом ПЦР, клонирован в оригинальный вектор экспрессии, получен эффективный штамм-продуцент CASA. Разработана аналитическая методика определения ферментативной активности CASA, которая позволяет характеризовать по синтетазной активности биомассу клеток рекомбинантного штамма, получаемые из нее ферментные препараты разной степени очистки и гетерогенный биокатализатор на основе CASA. Методика позволит в рамках работ по данному проекту осуществить отбор наиболее перспективных вариантов рекомбинантного штамма – продуцента CASA, разработать и оптимизировать методы биосинтеза, выделения, очистки и иммобилизации CASA с целью создания лабораторной методики получения технологического биокатализатора на основе рекомбинантной CASA. Разработанные аналитические методы послужат основой для создания Технических условий на технологический биокатализатор на основе рекомбинантной CASA. Разработан метод разделения компонентов реакционной смеси, образующейся при биокаталитическом синтезе цефазолина с использованием ВЭЖХ. Метод обеспечивает хроматографическое разделение и количественное определение обоих субстратов процесса биокаталитического синтеза, целевого и побочного продуктов, а также возможных примесей, содержащихся в исходных компонентах. Разработана аналитическая методика контроля процесса биокаталитического синтеза цефазолина, позволяющая проводить операционные испытания технологического биокатализатора на основе CASA с целью определения таких технологических характеристик как максимальная степень превращения бета-лактим-содержащего субстрата в цефазолин и период полуинактивации биокатализатора, а также осуществлять динамический контроль процесса синтеза для исследовательских целей.
На основании аналитического обзора информационных источников по биокаталитическому синтезу бета-лактамов-кислот сделан вывод что работы, запланированные по данному соглашению обладают новизной и соответствуют мировому научно-техническому уровню.