Регистрация / Вход
Прислать материал

Получение бифункциональных терапевтических антител для профилактики вирусных заболеваний при мукозальном применении

Докладчик: Кирпичников Михаил Петрович

Должность: Декан биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, декан

Цель проекта:
1.Для профилактики вирусных заболеваний существенное значение представляет разработка способов предотвращения попадания вирусных частиц в организм человека, а также их уничтожение при первичном контакте с органами и тканями больного. Такая задача актуальна для профилактики большинства вирусных инфекций, среди которых, основное эпидемиологическое значение, безусловно, представляет инфекция вирусом гриппа. Решение данной проблемы возможно при использовании рекомбинантных специфических вирус-направленных антител IgA-изотипа. 2. Создание эффективного, доступного и безопасного средства профилактики инфекции различными серотипами вируса гриппа А на основе специфических вирус-направленных антител IgA-изотипа, обепечивающих направленную активацию системы врожденного иммунитета слизистых оболочек человека при мукозальном применении.

Основные планируемые результаты проекта:
1. В результате выполнения работ ожидается достижение следующих основных результатов:
1) будут разработаны генетические конструкции и оптимальные системы экспрессии бифункциональных IgG/IgA- гибридных антител различного биоинженерного формата (мономерные и димерные формы природного иммуноглобулина А);
2) Будут получены клеточные линии СНО - продуценты бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител различного биоинженерного формата;
3) Будут проведены оптимизация биосинтеза, разработка эффективных методов выделения и очистки бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител, повышение выхода целевого продукта и стабильности конечной субстанции;
4) Будут получены 4 экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител;
5) Будут проведены биохимический и иммунохимический анализ экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA- гибридных антител, определена оптимальная терапевтическая доза и композиция для мукозального применения;
6) Будут проведены биологические испытания эффективности и безопасности 4-х экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител на модельных животных, летально инфицированных различными коллекционными штаммами.

2. В результате выполнения проекта будут получены адресные бифункциональные агенты - IgG/IgA- гибридные антитела, обладающие способностью элиминировать вирусные частицы и зараженные ими клетки непосредственно на стадии проникновения вируса в организм человека, что обеспечит профилактический эффект и не позволит развиться заболеванию. Бифункциональный эффект будет обусловлен, с одной стороны, способностью вариабельных доменов человеческого иммуноглобулина G узнавать поверхностные антигены различных серотипов вируса и тем самым обеспечивать адресность доставки. С другой стороны, активация защитного иммунитета будет производиться с помощью второго белкового модуля адресной системы доставки - константного домена человеческого иммуноглобулина А.
Терапевтическая доза IgG/IgA-гибридных антител при мукозальном применении не должна превышать 0,1 мг/кг веса у опытных животных, что в 100-150 раз меньше, чем при внутривенном введении противовирусных антител IgG-изотипа. Связывание с белками вирусной оболочки вирусов должно характеризоваться параметром EC50 не более 500 нг/мл. Это позволит в дальнейшем разработать на основе бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител недорогое эффективное лекарственное средство для профилактики вирусных заболеваний.

3. Разрабатываемые бифункциональные IgG/IgA-гибридные антитела представляют собой новый класс антивирусных препаратов, обладая рядом значительных преимуществ.
1) данные препараты обладают возможностью узнавать и уничтожать вирусные частицы различных серотипов, что позволяет ожидать высокой эффективности профилактического эффекта вне зависимости от конкретного сезонного штамма вируса.
2) предлагаемое терапевтическое антитело будет полностью человеческим, т.е. не будет содержать отдельные домены мышиного или какого-либо другого антитела. Данное антитело будет характеризоваться или полным отсутствием или чрезвычайно низкой иммуногенностью, что повысит эффективность терапевтического воздействия. По сравнению с известными препаратами для лечения гриппа предлагаемое лекарственное средство будет характеризоваться минимумом побочных эффектов и не обладать токсичностью, что делает его особенно востребованным для профилактики заражения гриппом у детей, беременных женщин, пациентов с ослабленной иммунной системой.

4. На рынке не представлены терапевтические антитела IgA класса. Разрабатываемый препарат представляет собой принципиально новый формат антивирусных средств на основе рекомбинантных антител. Его ближайшим аналогом является препарат Синагис (Synagis), выпускаемый компанией Эббот Берингер Ингельхайм Фарма ГмбХ и Ко., Германия. Этот препарат, представляющий собой гуманизированное моноклональное антитело IgG класса, зарегистрирован в Российской Федерации для использования в качестве средства профилактики у детей тяжелой инфекции нижних дыхательных путей, вызванной респираторно-синцитиальным вирусом.
В отличие от использования антител IgG класса, требующих внутривенного введения, высоких дозировок (2 – 20 мг/кг веса) и, как следствие, высокой стоимости лечения (20-40 тыс. руб. за терапевтический курс) использование бифункциональных IgG/IgA- гибридных антител для обработки слизистой позволит уменьшить терапевтическую дозу до 0,1 мг/кг веса у опытных животных, позволит значительно, в 100 - 150 раз по сравнению с внутривенным введением, уменьшить терапевтическую дозу.

5. В рамках выполнения теоретической части работ будет проведено обоснование экспериментальных и методических подходов для решения задач, поставленных в рамках ПНИ, в том числе, подходов для получения IgG/IgA – гибридных антител в клеточных линиях-млекопитающих и разработки средств профилактики вирусных заболеваний при мукозальном применении. Будут получены 4 экспериментальных образца образца бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител, содержащих вариабельный домен уникального человеческого антитела, обладающего специфичностью и нейтрализующей активностью в отношении значительного числа серотипов вируса гриппа А. Различные варианты экспериментальных образцов будут сконструированы на основе различных изоформ константных доменов иммуноглобулина А, . Для получения соответствующих рекомбинантных белков будут получены генетические конструкции, позволяющие экспрессировать указанные варианты антител в клеточных линиях млекопитающих в функциональном виде. Предлагаемое терапевтическое антитело будет полностью человеческим. Данное антитело будет характеризоваться или полным отсутствием или чрезвычайно низкой иммуногенностью, что повысит эффективность терапевтического воздействия.

Важной задачей проекта является разработка эффективных способов биосинтеза, повышения выхода целевого продукта и стабильности конечной субстанции. Для получения бифункциональных IgG/IgA- гибридных антител в количествах, достаточных для осуществления биологических испытаний, биохимического и иммунологического анализа будут получены клеточные линии млекопитающих СНО – продуценты рекомбинантных антител. При селекции линий будут использованы методы высокопроизводительного клеточного сортинга с помощью метода автоматизированной визуализации и флуоресцентного анализа индивидуальных клонов (Система ClonePIX FL, Molecular devices, Великобритания).

Для каждого из полученных экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител будет осуществлен биохимический и иммунохимический анализы аффинности и кросс- реактивности на препаратах коллекции серотипов вируса гриппа А. Для оценки биологических свойств разрабатываемых продуктов будут использованы коллекции всех известных серотипов вируса гриппа А и экспериментальные животные, летально инфицированные различными штаммами из коллекции НИИ гриппа Минздрава РФ.


Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Общий стоимостной объем продаж лекарственных препаратов для профилактики и лечения гриппа составил в 2012 г. 29,5 млрд. руб. Основными препаратами являлись Арбидол (5,015 млрд. руб.), Терафлю (3,83 млрд. руб.), Оциллококцинум (2,65 млрд. руб. ), Кагоцел (2,64 млрд. руб.), Анаферон (2,52 млрд. руб.). Ни один из представленных на рынке препаратов не обладает свойствами адресной элиминации вирусных частиц различных серотипов вируса гриппа А еще на стадии первичного контакта возбудителя с организмом человека. Каждый из перечисленных препаратов представляет собой по сути дела искусственно синтезированный экзогенный для организма человека препарат с различным набором побочных эффектов.
Перечисленные свойства создаваемого иммунопрепарата свидетельствуют о том, он может быть рекомендован в первую очередь для специфической профилактики заражения гриппом пациентов групп риска (дети, пожилые люди, беременные женщины, люди, страдающие диабетом, астмой, сердечно- сосудистыми заболеваниями, люди с ослабленной системой), а также для профилактики и лечения населения в целом. Кроме того, разработка препарата уменьшит затраты системы здравоохранения на получение сезонных вакцин и борьбу с возможными пандемиями. Потребителями ожидаемого результата являются население через аптечную систему, лечебно-профилактические учреждения, производители товаров для медико-биологического сектора экономики России, вся система здравоохранения в целом.

2. На завершающей стадии проекта будут проведены работы, целью которых является разработка технических требований и предложений по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера – ФГУП НПО «Микроген» Минздрава РФ. В результате выполнения исследований эффективности и безопасности экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител будет выбран прототип создаваемого лекарственного препарата . В 2017 г. планируется проведение ОТР по масштабированию процесса биосинтеза бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител, будет получен опытный образец для проведения доклинических исследований. Доклинические исследования препарата будут осуществляться с учетом особенностей его мукозального использования. В 2018-19 гг. планируется разработка промышленного технологического регламента получения мукозального средства профилактики вирусных заболеваний, постановка препарата на производство. Одновременно будут проводиться клинические испытания. По результатам работ будет подготовлено регистрационное досье и осуществлена процедура регистрации нового средства для профилактики вирусных инфекций.

3. Выполнение проекта позволит не только провести разработку новых терапевтических средств для лечения и профилактики гриппа, но и сформировать значительный научно-технический задел в новой области иммунофармакологии, основанной на использовании рекомбинантных IgG/IgA-гибридных иммуноглобулинов против различных возбудителей. Полученные знания и технологическая составляющая в области биоинженерии, получения и очистки, разработки лекарственных форм препаратов могут быть использованы для получения гомологичных препаратов для лечения бактериальных и вирусных инфекций.



Текущие результаты проекта:
Получены прототипы бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител на основе антител IgG-подкласса. Сконструирован рекомбинантный Fab-фрагмент антитела, специфичный в отношении ряда серотипов вируса гриппа А. Разработана и оптимизирована система экспрессии данного прототипа в клетках E.coli. Проведено выделение и очистка экспериментального образца на основе рекомбинантного Fab-фрагмента. Подтверждена способность данного антитела специфично связываться с рядом серотипов вируса гриппа А.
Осуществлено получение экспрессионной конструкции для создания стабильной линии-продуцента полноразмерного антитела IgG-изотипа для использования в качестве контроля биологической активности бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител при мукозальном применении.
Начата работа по получению стабильной линии СНО - продуцента полноразмерного антитела IgG-изотипа.

Завершено составление аналитического обзора информационных источников по теме проекта.
В завершающей стадии находятся составление Отчета о патентных исследований по теме проекта, а также
разработка Плана экспериментальных исследований, направленного на создание бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител.