Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка экспериментального образца регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации маркеров социально-значимых заболеваний в сыворотке крови.

Докладчик: Набиев Игорь Руфаилович

Должность: Зав. лабораторией, профессор, д-р. хим. наук

Цель проекта:
1. Разработка экспериментального образца регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации маркеров социально-значимых заболеваний в сыворотке крови. 2. Цели выполнения ПНИ: 2.1. Создание экспериментального образца регенрируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации белковых маркеров социально-значимых заболеваний в сыворотке крови, разрабатываемого на основе методы иммуноферментного анализа (ИФА) "сэндвич" - типа. 2.2. Достижение более высокой (в сравнении с аналогами) аналитической чувствительности экспериментального образца регенерируемого нанопроводного биосенсора. 2.3. Обеспечение возможности многократного использования экспериментального образца регенерируемого нанопроводного биосенсора.

Основные планируемые результаты проекта:
1. В ходе выполнения ПНИ должны быть получены следующие научно-технические результаты:
1.1 Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ, содержащие:
а) описание лабораторной технологии изготовления экспериментальных образцов регенерируемого нанопроводного биосенсора (далее – биосенсор) в виде чипов, представляющих собой кристалл с массивом нанопроволочныхструктур, активированных аффинными реагентами к целевым белкам: клинически значимым формам простатического специфического антигена (PSA): свободному и связанному PSA, а также карциноэмбриональному антигену (CEA), раковым антигенам CA 15-3 и CA 27.29;
б) результаты экспериментальных и теоретических исследований и апробации вновь разработанных технических принципов и методических подходов при выполнении исследований по влиянию параметров массивов и морфологии нанопроволок, формирующих фотонный кристалл, на оптические характеристики биосенсора, чувствительность к целевым белкам, а также регенерируемость биосенсора;
в) оценка полноты решения задачи и достижения поставленных целей ПНИ.
1.2 Лабораторный регламент изготовления экспериментальных образцов биосенсоров для регистрации целевых белков.
1.3 Проект инструкции по эксплуатации биосенсора для регистрации целевых белков.
1.4 Отчет о патентных исследованиях, оформленный в соответствии с ГОСТ 15.011-96.
1.5 Технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера - организации реального сектора экономики.
1.6 Методика переведения квантовых точек в водную фазу с сохранением высокой коллоидной стабильности квантовых точек и значения квантового выхода фотолюминесценции не менее 50%.
1.7 Методика получения конъюгатов квантовых точек с детекторными антителами, высокоспецифичными к маркерам рака молочной железы и рака простаты.
1.8 Методика подготовки поверхности биосенсора к модификации аффинными молекулами, включающего стадии термического окисления поверхности, силанизации, и обработки молекулами-линкерами.
1.9 Проект технического задания на проведение ОКР по теме: «Разработка опытного образца регенерируемого биосенсора для детектирования маркеров заболеваний в сыворотке крови».
1.10 Методика регенерации биосенсора для повторного использования.
1.11 Экспериментальные образцы высоколюминесцентных квантовых точкек на основе селенида кадмия, имеющих квантовый выход фотолюминесценции >90% в органической фазе.
1.12 Экспериментальные образцы регенерируемого нанопроводного биосенсора в виде чипов, представляющих собой кристалл с массивом нанопроволочныхструктур, активированных аффинными реагентами к целевым белкам: клинически значимым формам простатического специфического антигена (PSA): свободному и связанному PSA, а также карциноэмбриональному антигену (CEA), раковым антигенам CA 15-3 и CA 27.29.
1.13 Экспериментальные образцы коньюгатов детекторных антител с квантовыми точками.
1.14 Экспериментальный образец корпусного адаптера.

2.1 Результаты ПНИ предназначены для клинической диагностики онкологических заболеваний, в частности, для обнаружения онкологических заболеваний на ранних стадиях развития, для оценки эффективности терапии, раннего выявления рецидивов и метастаз.
2.2 Экспериментальные образцы регенерируемого нанопроводного биосенсора должны соответствовать техническим требованиям, приведенным в таблице 1.
Таблица 1.
Показатель Единицы измерения Значение показателя
Время проведения анализа часов не более 3
Объем анализируемого биоматериала - целевых белков (антигенов рака груди или рака простаты) мкл не менее 10
Аналитическая чувствительность детекции целевых белков (антигенов рака груди или рака простаты) моль/л не более 10-15
Число контрольных нанопроволочных структур на одном биосенсоре шт. не менее 2
Количество анализов, выполняемых с помощью одного биосенсора - не менее 5
Точность измерения концентрации целевого белка в образце с использованием одного биосенсора в трех повторах % не более 50
Точность измерения концентрации целевого белка с использованием экспериментальных образцов биосенсора одной партии % не более 50

3-4. Одной из актуальных задач современной медицины является ранняя диагностика онкологических заболеваний, которые входят в перечень социально-значимых заболеваний человека, утвержденный Правительством РФ В результате аномальной экспрессии генов, в опухолевых клетках продуцируются онкомаркеры – опухолевые антигены, содержание которых в биологических жидкостях и тканях являются важнейшим информативным показателем развития опухолевого процесса. Диагностика наличия онкомаркеров позволяет выявить болезнь на ранних стадиях, а также оценить эффективность проводимой терапии. Несмотря на то, что на настоящий момент уже известны более 200 онкомаркеров (и все новые специфические онкомаркеры продолжают выявляться), их детекция и связанная с этим клиническая диагностика эффективны пока лишь для некоторых видов рака . Разработка и совершенствование методов детекции онкомаркеров является одной из приоритетных задач современной медицины от решения которой зависит судьба милионов людей.
Для выявления наличия и определения содержания онкомаркеров в биологических жидкостях, современная клиническая диагностика широко использует метод иммуноферментного анализа (ИФА). Несмотря на заметные успехи, достигнутые при использовании этого метода, он не позволяет одновременно детектировать несколько биомаркеров в одном биологическом образце, а также требует использовать относительно большие объемы образцов, что делает этот метод довольно затратным, а также, в случае использования биопсий, крайне болезненным для пациентов. В связи с этим, грядущие перспективы и прорывные результаты в развитии ранней диагностики заболеваний в медецине будущего связывают с комплексными системами детекции онкомаркеров, позволяющими проводить одновременный количественный и многопараметрический анализ и выявлять малые количества большого количества онкомаркеров в одном биологическом образце.
Задачей настоящего ПНИ является создание экспериментального образца инновационной диагностической системы, основанной на регенерируемом нанопроволочном биосенсоре для одновременной регистрации ряда онкомаркеров в сыворотке крови. Данная система будет обладать большей чувствительностью при использовании меньших количеств биоматериала по сравнению с традиционной широко используемой системой на основе ИФА. Биосенсор для регистрации маркеров рака молочной железы и рака простаты будет представлять собой массив кремниевых нанопроволок на кремниевой подложке, формирующих фотонную структуру способную усиливать излучение флуоресцентных меток, используемых для детекции онкомаркера. В основе системы детекции будет заложен формат ИФА. В качестве детектирующих флуоресцентных меток будут использованы квантовые точки (КТ), новый класс флуорофоров, обладающих принципиальными преимуществами по сравнению с традиционно используемыми органическими флуорофорами. КТ представляют собой неорганические полупроводниковые нанокристаллы размером 2-10 нм. В отличие от органических флуорофоров, для КТ характерны широкие области поглощения и возбуждения и, в то же время, узкие и симметричные пики флуоресценции. Интенсивность флуоресценции КТ превышает таковую для органических флуорофоров более чем в 100 раз, а фотостабильность – в несколько тысяч раз. Положение пика флуоресценции КТ нелинейно зависит от размера ядра нанокристалла. При этом, за счет уникальной формы квазинепрерывных спектров возбуждения КТ, покрывающих диапазон от УФ до ближней ИК области оптического спектра, нанокристаллы различных размеров (а, следовательно, и различных цветов) могут быть одновременно возбуждены светом одной длины волны. Подобное свойство со всей очевидностью открывает возможности для создания многопараметрических систем c одновременной детекцией нескольких биомаркеров (меченных КТ разных цветов) в одном образце. Для применения КТ в биологических и медицинских целях, их поверхность модифицируют с тем, чтобы придать им стабильность в водных средах и биологических жидклстях и тканях. В состав полярной оболочки КТ вводят функциональные группы (как правило, гидроксильные, карбоксильные или аминогруппы), что позволяет варьировать заряд поверхности полученных частиц, а также осуществлять их химическую сшивку с различными биологическими молекулами – белками, пептидами, антителами, нуклеиновыми кислотами. Подобный подход позволяет получать диагностические флуоресцентные нанометки, обладающие рекордной яркостью, фотостабильностью, а также позволяющие детектировать несколько онкомаркеров в одной биологической пробе, взятой у пациента. Кроме этого, использование диагностических меток на основе КТ позволяет достигать чувствительность определения биомаркеров, в том числе и онкомаркеров, существенно превышающую чувствительности лучших современных методов клинической диагностики.
В создаваемом в настоящем проекте биосенсоре для детекции биомаркеров будут использованы флуоресцентные метки на основе конъюгатов КТ с антителами. Уникальность предлагаемой системы заключается в том, что флуоресцентный сигнал КТ будет усилен за счет фотонной структуры, выступающей в качестве подложки для иммуносэндвича - ключевой системы метода ИФА.
Фотонный кристалл – это среда с периодически меняющейся диэлектрической проницаемостью, приводящей к брэгговской дифракции света. Введение флюорофоров в фотонную структуру приводит к изменению спектра их излучения, получаемого на выходе из кристалла. В частности, при введении полупроводниковых квантовых точек в фотонные кристаллы на основе кремния, наблюдается как сужение спектра люминсеценции на порядок, до величин порядка нескольких нанометров, так и усиление люминесцентного сигнала. Подобные свойства фотонных кристаллов находят широкое применение в задачах биомедицинской детекции и диагностики. В предлагаемом ПНИ планируется создание двумерного фотонного кристалла, представляющего собой массив кремниевых нанопроволок на подложке монокристаллического кремния, формирующих микрорезонатор с модой, совпадающей, в присутствие детекторных антител, с длиной волны максимума люминесценции квантовых точек. В результате действия такого микрорезонатора, люминесценция КТ будет усилена в узкой линии, что приведет к повышению аналитической чувствительности биосенсора. Использование именно двумерной фотонной структуры обеспечит возможность эффективного проникновения аналита вглубь резонатора и приведет к эффективной модуляции спектра излучения, что позволит повысить чувствительность определения аналитов в образцах. Кроме этого, предлагаемая схема позволит эффективно промывать весь объем микрорезонатора, обеспечивая регенерируемость биосенсора.


5. Разработка биосенсора будет проводиться в несколько этапов.
5.1 На первом этапе исследования будет проведено математическое моделирование распределения электромагнитной волны в фотонной структуре и оптимизация параметров планируемой к созданию фотонной структуры для получения максимального сужения и усиления сигнала введенного флюорофора. При этом будут учитываться ограничения, накладываемые необходимостью обеспечения доставки детектируемых белков к иммобилизированным антителам, а также регенерации сенсора путем отмывки. Моделирование планируется проводить методом конечных разностей во временной области (FDTD, Finite Difference Time Domain). В качестве базовой структуры сенсора выбран двумерный фотонный кристалл, сформированный массивом нанопроволок. Предлагаемая схема позволяет добиться достаточно высокой добротности резонатора в сочетании с возможностью прямого доступа аналита в объем фотонного кристалла, а также предусматривает возможность его регенерации методами отмывки.
5.2 На втором этапе исследования будет создана подложка биосенсора, представляющая собой упорядоченный массив нанопроволок, формирующих двумерную фотонную структуру. Подложка будет сформирована через металлическую (никелевую) маску при помощи методики реактивного ионного травления (РИТ, RIE). Данный процесс позволяет травить кремниевую пластину анизотропно, в отличие от жидкостного химического травления. Металлическая маска будет сформирована методом электронно-лучевой литографии (ЭЛЛ, EBL), отличающимсявысокой разрешающей способностью, достигающей 10 нм, а также высокой повторяемостью размеров структур, формируемых внутри массива (погрешность составляет порядка 1%). В дальнейшем, поверхность подложки будет подвергнута электрохимическому травлению для придания ей пористости и увеличения площади поверхности сенсора.
5.3 На третьем этапе, аналитическая площадь поверхности сенсора (а именно, поверхность нанопроволок) будет сделана полярной и функционализирована для последующей конъюгации с антителами, способными специфично распознавать онкомаркеры. Процесс модификации поверхности кремниевых нанопроволок будет включать:
- термическое окисление поверхности массива нанопроволок на глубину до 10 нм с целью введения активных силанольных групп Si-(OH)2, пригодных для проведения дальнейшей функционализации;
- силанизацию: модификацию окисленной поверхности массива нанопроволок 3-аминопропилтриэтоксисиланом с целью введения на поверхность нанопроволок функциональных аминогруп ( NH2);
- введение на поверхность нанопроволок карбоксильных групп для последующей ковалентной пришивки распознающих антител, производимое посредством обработки поверхности сенсора ангидридом янтарной кислоты;
- оптимизация условий модификации поверхности с целью достижения максимального числа центров связывания распознающих антител на активной поверхности сенсора.
5.4 На четвертом этапе поверхность нанопроволок будет активирована путем введения бифункциональных сшивающих реагентов. Затем активированная подложка будет приведена в контакт с распознающими антителами, которые необратимо свяжутся с поверхностью подложки посредством образования ковалентных связяй. Способ иммобилизации антител на поверхности нанопроволок, а также условия конъюгации (рН, концентрации реагирующих веществ, время инкубации и др.) будут оптимизированы. Таким образом будет получен биосенсор, пригодный для дальнейшей отработки методики регистрации белковых маркеров рака молочной железы и рака простаты в образцах сывороток крови человека.
5.5 Будут синтезированы высоколюминесцентные квантовые точки на основе селенида кадмия, имеющие квантовый выход (КВ) люминесценции не менее 90% в органической фазе. Далее будет произведена их обработка производными полиэтиленгликоля (ПЭГ), содержащими карбоксильные, гидроксильные, или аминогруппы, а также их смесями с контролируемым процентным содержанием каждого производного ПЭГ, для перевода КТ в водную фазу с сохранением КВ не менее 50%. Очистка суспензий солюбилизированных КТ от избытка ПЭГ будет осуществляться методом гель-проникающей хроматографии. Будет проведен анализ очищенных суспензий методом динамического светорассеяния и измерен ξ-потенциал поверхности солюбилизированных КТ.
5.6 Будет разработана методика получения конъюгатов КТ с детекторными антителами, высокоспецифичными к маркерам рака молочной железы и рака простаты.
5.7 Методика регистрации белков - маркеров рака молочной железы и рака простаты в образцах сывороток крови человека будет включать следующие этапы:
- блокировка биосенсора с иммобилизованными на его поверхности антителами с помощью буферных растворов, содержащих бычий сывороточный альбумин (БСА) или казеин, для предотвращения неспецифического связывания биомолекул и биоконъюгатов с поверхностью биосенсора;
- нанесение в лунки биосенсора образцов сыворотки крови человека и контрольных образцов; инкубация в течение 40-60 минут;
- отмывка биосенсора от анализируемых растворов;
- нанесение растворов конъюгатов КТ с детекторными антителами, специфичными к онкомаркерам; инкубация в течение 40-60 минут;
- отмывка биосенсора от избытка несвязавшихся конъюгатов;
- анализ флуоресценции биосенсора, который будет осуществляться на стандартном оборудовании для анализа флуоресценции в планшете для ИФА;
5.8 Будет отработана методика регенерации биосенсора после проведения анализа. Регенерация будет заключаться в промывке биосенсора специальным регенерирующим раствором, который разрушает специфические связи антиген-антитело, но при этом позволяет сохранить пространственную структуру и активность иммобилизованных на подложке антител.
5.9 Конструкция корпуса биосенсора будет соответствовать стандартным планшетам, используемым в стандартных анализах методом ИФА. За счет уникальных спектральных свойств КТ (одновременное возбуждение флуоресценции нескольких типов меток светом одной длины волны) будет обеспечена возможность одновременной детекции нескольких маркеров в отдельных ячейках биосенсора.
В результате проведенной работы будет получен уникальный регенерируемый биосенсор для обнаружения биомаркеров социально-значимых (онко)заболеваний в сыворотках крови человека с чувствительностью, превышающей 10-15 моль/л.
В ходе исследования будут систематически изучены следующие факторы, влияющие на оптические характеристики биосенсора, его чувствительность к целевым белкам, а также регенерируемость биосенсора:
- влияние параметров массивов нанопроволок, формирующих фотонный кристалл (толщина нанопроволок, расстояние между ними);
- влияние параметров морфологии нанопроволок, формирующих фотонный кристалл (кривизна и площадь поверхности нанопроволок);
- выбор способа модификации поверхности нанопроволок;
- выбор способа ковалентной иммобилизации, а также количества антител на поверхности нанопроволок;
- влияние состава регенерирующего раствора и условий промывки
Изучение этих факторов позволит произвести оптимизацию принципиальной схемы и конструкции биосенсора для достижения заявленных характеристик.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1.
Областью применения ожидаемых результатов является лабораторная клиническая диагностика онкологических заболеваний и, в частности, обнаружение онкозаболевания на ранних стадиях развития, когда патологический очаг невозможно диагностировать другими методами. Онкомаркеры позволяют диагностировать опухоли и обнаружить метастазы за несколько месяцев до их обнаружения инструментальными (рентгенография, компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, ультразвуковое исследование), цито- и гистологическими методами. Одновременная диагностика нескольких маркеров (например, маркеров рака молочной железы CEA, CA 15-3, CA 27.29) в формате одного биосенсора позволит провести комплексный анализ и при этом сэкономить биоматериал и уменьшить количество затрачиваемого времени на анализ.

Не менее значимым является контроль содержания онкомаркеров в крови для оценки эффективности терапии, раннего выявления рецидивов и метастаз.
Несмотря на то, что на данный момент известно более 200 онкомаркеров, в клинической практике используют только около 20 из них. Ограничение их использования связано с большой вариабельностью результатов в зависимости от конкретного пациента, сложностью трактовки результатов анализа, а также с тонкими отличиями в методах отбора и обработки биологических проб, что может приводить к серьезным систематическим ошибкам. Однако, и сейчас в научных лабораториях ведутся активные поиски новых онкомаркеров, которые могут быть внедрены в клиническую практику, обеспечивая большую чувствительность и надежность проводимых анализов. Принципиальная схема биосенсора, предлагаемая в настоящем проекте, может быть адаптирована для анализа не только онкомаркеров рака молочной железы и рака простаты, но и других видов рака. Кроме того, после замены использумых в разрабатываемом прототипе антител на антитела, специфичные к биомаркерам других социально-значимых заболеваний, создаваемая диагностическая система будет применима для всех видов анализа, в основе которых лежит принцип ИФА.

2-3.
Возможными потребителями результатов, полученных в ходе выполнения данной ПНИ, являются научные и индустриальные организации, работающие в области создания, исследования свойств и контроля качества широкого класса функционализированных нанокомпозитных материалов и высокоэффективных фотонных структур.
Не мене важными потребителями результатов ПНИ являются организации, занимающиеся биомедицинскими и биологическими исследованиями, в частности Индустриальный партнер проекта компания «Наномультиплекс» - малое динамично развивающееся инновационное предприятие, резидент «Сколково». Деятельность компании направлена на создание и коммерциализацию качественно нового класса инструментов (наборов реагентов и аналитических приборов) для высокоточной и многопараметрической ранней диагностики онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний человека с помощью флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек), которые превосходят существующие аналоги по чувствительности при детекции биомаркеров заболеваний - более чем в 100 раз и по фотостабильности более чем в 1000 раз. Кроме того, компания «Наномультиплекс» существенно расширяет диапазон применения флуоресцентных квантовых точек, разрабатывая подходы к созданию различных нанокомпозитных материалов на основе органических матриц (полиметилметакрилат, полистирол, полисилоксаны, органические полупроводники и полимерно-сшитые жидкокристаллические смеси), допированных флуоресцентными квантовыми точками.
Возможные пути и необходимые действия по доведению до потребителя ожидаемых результатов:
1. Публикация результатов ПНИ в высокорейтинговых специализируемых научных изданиях и участие в конференциях.
2. Проведение дополнительной ОКР, направленной на создание промышленного прототипа биосенсора для регистрации маркеров социально-значимых заболеваний в сыворотке крови.
3.Предклинические испытания промышленного прототипа биосенсора государственной научной организации (ФГБУ Российский онкологический центр имени Н.Н. Блохина Российской академии наук).
4. Предоставление лицензии индустриальному партнеру (ООО «Наномультиплекс») с целью промышленного производства биосенсора.
5. Привлечение венчурного капитала для организации промышленного производства биосенсора.
6. Продвижение данного оборудования с помощью проведения соответствующей маркетинговой компании.


Текущие результаты проекта:
В ходе выполнения экспертного анализа проводится обзор научной литературы на тему современных достижений в области регистрации маркеров онкозаболеваний в сыворотке крови и перспективе применения фотонных кристаллов для улучшения чувствительности детектирования. На основе полученных данных будет обоснован выбранный метод детектирования, тип используемых фотонных кристаллов, а также выбраны приоритетные направления исследования.
В ходе выполнения работ, был разработан и опробирован метод изготовления массивов нанопроволочных структур с помощью групповой обработки кристаллов кремния методом электронно-лучевой литографии с дальнейшим применением реактивного ионного травления. Морфология полученных массивов нанопроволочных структур была исследована с помощью растрового электронного микроскопа. Были измерены параметры полученной периодической структуры нанопроволок, а также их диаметр.
Начата подготовка к изготовлению высоколюминесцентных квантовых точек CdSe/Z S имеющих квантовый выход фотолюминесценции до 90% в органической фазе.
Проводимый аналитический обзор современной научно-технической литературы показал, что, метод иммуноферментного анализа (ИФА) широко используется в современной клинической диагностике для выявления инфекционных, аутоиммунных, эндокринных и онкологических заболеваний. Метод ИФА является высокоспецифичным и высокочувствительным методом, позволяющим количественно определять содержание вещества в биологических жидкостях вплоть до нескольких пикограмм. Использование флуресцентно-меченых антител вместо ферментов позволяет значительно повысить чувствительность ИФА-анализа. При диагностике онкологических заболеваний для повышения точности диагноза целесообразно проводить анализ сразу нескольких онкомаркеров. Однако, для проведения одновременной комплексной диагностики увеличивается и количество необходимого биоматериала для анализа. В связи с этим возрастает необходимость разработки методов анализа, позволяющих использовать минимальный объем биологического материала для высокочувствительного количественного определения онкомаркеров. На сегодняшний день значения по чувствительности определения онкомаркеров стандартным ИФА-методом с использованием коммерческих китов составляют: 8 пг/мл для PSA, 3 пг/мл для CEA, 5 МЕ/мл для CA 15-3 и 15 МЕ/мл для ракового антигена CA 27-29. Диагностическая чувствительность определения раковых антигенов прежде всего зависит от константы связывания антиген-антитело. Этот факт означает, что использование новых антител, более специфичных к онкологическим маркерам, позволит понизить порог детекции. Кроме этого, использование флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов также позволяет повысить чувствительность детекции за счет их более высокой яркости и стабильности к выгоранию по сравнению с применяемыми сейчас органическими красителями, что позволяет производить накопление сигнала. Кроме того, все больше работ посвящено разработке технологии 2D-микрочипов для высокоточной диагностики онкомаркеров и суспензионных микросистем. Использование двумерных фотонных кристаллов, представляющих собой массивы нанопроволок, в качестве подложки для проведения ИФА может существенно повысить чувствительность метода за счет более эффективного связывания, усиления оптического сигнала люминесцентной метки в резонаторе (рекордная добротность микрорезонаторов на основе двумерных фотонных кристаллов достигает значений порядка 10^6), при этом обеспечивается возможность уменьшения количества используемого биоматериала и регенерируемость биосенсора. В качестве материала для изготовления двумерных фотонных кристаллов хорошо себя зарекомендовал монокристаллический кремний, технология обработки которого наиболее развита в настоящий момент. Фотонный кристалл может быть сформирован методом реактивного ионного травления кремния через никелевую маску, созданную при помощи электронно-лучевой литографии. Использование никеля обусловлено малой скоростью его травления относительно кремния (высокая селективность), что позволяет получать более длинные нанопроволоки. Никелевая маска на поверхности кристалла кремния может быть создана при помощи метода электронно-лучевой литографии, преимущества которой заключаются в возможности формировать топологию без предварительного изготовления маски и разрешении менее 100 нм. Существует два способа селективного травления – химическое и реактивное ионное. Применительно к задаче формирования фотонных кристаллов оптимально применять реактивное ионное травление, так как данный метод не приводит к искажению фотонной структуры, имеет меньшее время травления и дает точность глубины травления до 1 нм, обеспечивая высокую селективность и сохранение нитевидной формы нанопроволок.

Результаты анализа литературы показали, что продолжение работ по проекту в соответствии с заявленным планом является целесообразным. Концепция разрабатываемого биосенсора и схема детекции соответствуют передовым направлениям мировых разработок.

Новизна разработки заключается в комбинации уникальных компонентов: усиливающей оптический сигнал подложки с двумерным фотонным кристаллом, высокоспецифичных антител и квантовых точек для флуоресцентной детекции маркеров заболеваний в методе ИФА, широко применяемом в клинической практике. Комбинация свойств этих компонентов позволяет ожидать от разрабатываемого биосенсора существенного повышения порога детектирования маркеров заболеваний в минимально возможном объеме проб.

Результаты по пункту 1.3 ПГ: На текущем этапе проекта была разработана методика приготовления подложек для ИФА – анализа, представляющих собой монокристалл кремния с массивом нанопроволочных структур. В качестве оптимальной структуры подложки сенсора был выбран массив нанопроволок круглого сечения, в качестве метода приготовления – реактивное ионное травление с применением никелевой маски, полученной электронно-лучевой литографией. В ходе работ по созданию никелевой маски были разработаны следующие процедуры:
1) подготовка кремниевой пластины к нанесению маски,
2) нанесение резиста для электронно-лучевой литографии,
3) экспонирование на электронно-лучевом литографе по заданной топологии массива,
4) проявление маски фоторезиста,
5) нанесение никеля на подложку методом термического напыления,
6) удаление никеля (“lift-off”) и остатка фоторезиста из экспонированных областей.
На этапе были оптимизированы параметры процесса: подобран наиболее подходящий резист и условия его нанесения, доза облучения, условия проявления маски резиста, условия нанесения никеля и удаления остатков материала. Подготовленные пробные образцы кремниевых подложек с нанесенной никелевой маской были протравлены в установке реактивного ионного травления. В качестве рабочего газа была использована смесь аргона, кислорода и гексафторида серы (SF6) при давлении 5 мТорр и мощности радиочастотного возбуждения 180 Вт. Морфология полученных пробных образцов массивов нанопроволок на плоской подложке была исследована с помощью растрового электронного микроскопа RAITH TWO. Характерный диаметр нанопроволок составляет порядка 200 нм, а расстояния между ними того же порядка величины, что соответствует заданной программно топологии образца. Таким образом, можно заключить, что на текущем этапе нами выполнена задача разработки метода получения кристаллов с массивом нанопроволочных структур, с параметрами, соответствующими заявленным в проекте требованиям, путем групповой обработки кристаллов методом электронно-лучевой литографии с дальнейшим применением метода реактивного ионного травления.
Проведены переговоры с потенциальными поставщиками расходных материалов для проведения научных исследований и синтеза квантовых точек. Разработана схема синтеза высоколюминесцентных квантовых точек типа ядро/многокомпонентная оболочка, обладающих рекордными значениями квантового выхода фотолюминесценции при малых размерах нанокристалла.