Регистрация / Вход
Прислать материал

Аналитическая система для персонифицированной идентификации биомаркеров, обуславливающих чувствительность к онколитической биотерапии

Докладчик: Чумаков Петр Михайлович

Должность: зав. лаб ИМБ РАН, профессор, д.б.н.

Цель проекта:
Проект направлен на повышение эффективности и предсказуемости биотерапии при лечении наиболее распространенных форм злокачественных заболеваний - рака легкого, простаты, молочной железы, толстого кишечника, шейки матки. Целью проекта является создание на основе постгеномных технологий аналитической системы по поиску и идентификации новых биомаркеров онкологических заболеваний, по которым возможно предсказание индивидуальной чувствительности опухоли к онколитической биотерапии и осуществлять подбор наиболее эффективного для конкретного пациента терапевтического штамма. Это позволит прогнозировать эффективность применения биотерапевтических онколитических штаммов с учетом индивидуальных особенностей опухоли конкретного пациента, проводить персонифицированный подбор оптимального курса онколитической биотерапии, а также разрабатывать новые онколитические препараты, обладающих более широким спектром противоопухолевого действия. Выявление новых биомаркеров будет проводиться преимущественно на основе транскриптомного анализа опухолей, с подтверждением методами высокопроизводительного протеомного анализа. После получения массива данных о представленности транскриптов всех генов индивидуальных опухолей будет проводиться биоинформатический анализ с целью выявления изменений в сигнальных путях, ответственных за противовирусную защиту клетки (включая способность опухолевых клеток индуцировать интерфероны в ответ на вирусную инфекцию и их способность реагировать на обработку интерферонами и формировать невосприимчивость к вирусной инфекции), а также об экспрессии других генов, влияющих на способность вирусов заражать и убивать клетки. Путем анализа большого числа опухолей различного происхождения будут выявлены новые биомаркеры, проведено подтверждение их влияния на восприимчивость к ряду онколитических вирусов в модельных системах in vitro (культурах опухолевых клеток с модификацией экспрессии испытуемых биомаркеров), и in vivo (на моделях ксенографтов опухолей человека в иммунодефицитных мышах). Будут разработаны алгоритмы выбора оптимальной персонифицированной онколитической терапии конкретного пациента. Проект также предполагает экспериментальную отработку принципиально нового подхода к преодолению формирования устойчивости злокачественных клеток к применяемой терапии, который использует генетическую конкуренцию эволюционирующих под действием терапии опухолевых клеток и онколитических вирусов, эволюционирующих в опухоли в сторону приобретения способности размножаться на ранее нечувствительных к вирусу опухолевых клетках. Установление возможности внутриопухолевой адаптации терапевтических вирусов откроет возможность для создания инновационных методов преодоления проблемы приобретенной устойчивости опухолей к терапии. Повышенная восприимчивость опухолевых клеток к онколитической биотерапии обусловлена как повышенной экспрессией факторов, способствующих проникновению вируса в клетки и его успешному размножению, так и утратой систем врожденного противовирусного иммунитета. Молекулярные изменения, придающие клеткам чувствительность к биотерапии могут служить биомаркерами, на основании которых можно предсказывать успех применения того или иного терапевтического штамма. Для идентификации наиболее характерных мишеней подвергающихся инактивации в различных типах опухолей требуется анализ множества клинических случаев, с последующим секвенированием транскриптома и биоинформатическим анализом. После установления этих мишеней дальнейший анализ образцов конкретных пациентов можно будет проводить путем ПЦР в реальном времени, что значительно ускорит и удешевит установление восприимчивости клеток к вирусам. Решение проблемы выбора оптимального варианта биотерапии у конкретного пациента станет возможным после последовательного решения ряда задач. Мы предполагаем следующую последовательность решения задач, которая позволит достигнуть поставленные цели проекта : - Сформировать обширную коллекцию опухолевого материала от пациентов, страдающих наиболее значимыми формами рака. Материал будет забираться во время хирургической операции или получения биопсии. Участки опухоли будут подвергаться быстрой консервации для обеспечения сохранности биомолекул (фиксация в консервирующем растворе), а также жизнеспособных клеток (криоконсервация). молекул РНК и ДНК (с применением фиксирующего реагента RNAlater). злокачественными клетками. - Выделить препараты РНК и провести секвенирование транскриптома опухолей по технологии NGS. Оптимизировать режимы секвенирования для количественного определения интенсивности транскрипции генов компонентов, участвующих во взаимодействии патогена и клетки, а также состояния компонентов врожденного противовирусного иммунитета, систем реакции клеток на стрессы, систем поддержания стабильности генома, компонентов сигнальных путей, ответственных за контроль пролиферации клеток и клеточную смерть. - Провести биоинформатический анализ и сравнение транскриптома ряда опухолей, имеющих общее тканевое происхождение с целью выявления закономерностей изменения транскрипции, идентификации изменений значимых для взаимодействия клеток с микробными и вирусными патогенами. - Отработать алгоритмы анализа транскриптом опухолевых клеток, с учетом тканевой принадлежности опухоли. Сосредоточиться на генах, экспрессия которых определяет тропизм того или иного типа онколитических штаммов, их способность проникать и размножаться в злокачественных клетках; на генах систем врожденного иммунитета, в частности; на генах обуславливающих индукцию интерферонов и генах интерферонового ответа; на генах, отвечающих на индукцию апоптоза в ответ на стрессорные воздействия. Разработанные алгоритмы будут запатентованы. - Верифицировать данные транскриптомного анализа путем высокопроизводительного анализа протеома. - Разработать процедуру культивирования фрагментов опухоли в органных культурах, позволяющую сохранять жизнеспособность клеток в течение 3-5 дней. Материал будет забираться во время хирургической операции в клиниках, подвергаться механической дезинтеграции, помещаться в питательную среду и инкубироваться у атмосфере с ограниченным содержанием кислорода (для предотвращения окислительного стресса). Будут отработаны условия продления времени жизни клеток в органной культуре путем варьирования ингредиентов среды и добавок. Будут отработаны условия для оптимального тестирования размножения онколитических вирусов. - Испытать способность панели онколитических штаммов размножаться и убивать клетки опухоли в органной культуре. Установить связь между экспрессией поверхностных рецепторов клетки, необходимых для проникновения вирусов, а также состояния противовирусных сигнальных путей со способностью опухолевых клеток размножать вирусы. - Верифицировать данные о влиянии новых биомаркеров на чувствительность к вирусам на модельных культурах клеток нескольких типов рака, имеющих вариации в экспрессии тестируемых биомаркеров. - На основании анализа данных по транскрипции выявленных биомаркеров и данных по экспериментальному определению чувствительности будет подобран и запатентован набор предсказательных биомаркеров, пригодных для подбора оптимально-эффективных для конкретного пациента терапевтических штаммов. - На основании выявленных биомаркеров будут разработаны и запатентованы новые диагностические тесты на основе ПЦР в реальном времени, которые позволят оперативно и количественно определять экспрессию биомаркеров чувствительности к биотерапии. - Разработать принципы и подходы для оперативной адаптации онколитических вирусов к опухоли пациента, состоящей из гетерогенного набора опухолевых клеток, различающихся по чувствительности к онколитическим штаммам вирусов. Будет установлена возможность «самонацеливания» онколитического вируса на опухолевые клетки, которые в ходе прогрессии приобретают устойчивость к терапии. Будет выделен и секвенирован и охарактеризован вирус, прошедший пассирование на смешанной опухоли, выяснена возможность его изменения в сторону приобретения тропизма к ранее нечувствительным типам клеток. По результатам будут разрабатываться варианты терапевтических схем и схем контроля за изменчивостью вируса в организме пациента. Полученный результат будет представлять предмет для правовой охраны, поскольку он заключает совершенно новый подход к лечению рака, решающий проблему приобретенной устойчивости к терапии.

Основные планируемые результаты проекта:
В результате успешного выполнения проекта будут созданы инновационные технологии, которые позволят:
Выявлять новые биомаркеры злокачественных заболеваний, коррелирующие с чувствительностью к онколитической биотерапией
Проводить оперативный анализ индивидуальных особенностей опухоли конкретного пациента с целью подбора наиболее эффективного варианта онколитической биотерапии
Будут разработаны алгоритмы для анализа транскриптома опухолей различного гистогенеза и сформированы оптимальные ПЦР тесты для экспресс-идентификации чувствительности и подбора оптимального штамма.
Будут созданы панели онколитических вирусов с расширенным спектром воздействия на опухоли различного типа и разработаны рекомендации по их последовательному применению с целью увеличения длительности терапевтического воздействия, повышающего вероятность полного удаления опухолевых клеток из организма больного.
Будет проведена экспериментальная верификация подхода по применению «самонацеливающихся» онколитических вирусов, что откроет перспективу для разработки новых терапевтических штаммов на основе вирусов с нестабильным геномом, которые смогут преодолеть проблему возникновения невосприимчивости к терапии и последующих рецидивов заболевания.
Аналитическая система будет запатентована, по результатам исследований будут опубликованы статьи в высокорейтинговых научных журналах, представлены сообщения на научных симпозиумах.
По окончании работы будет разработано технико-экономическое обоснование применения разработанной технологии в условиях клиник, сформулированы технические требования и предложения по ее эксплуатации индустриальным партнером.
Создаваемая аналитическая система для поиска биомаркеров чувствительности к онколитической биотерапии не имеет мировых аналогов.
На реалистичность успешного выполнения проекта указывают многочисленные экспериментальные заделы коллектива ИМБ РАН и участвующих в проекте организаций-соисполнителей.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Аналитическая система для персонифицированной идентификации биомаркеров, обуславливающих чувствительность к онколитической биотерапии предназначена для применения в онкологических клиниках с целью тонкой дифференциации заболеваний конкретного пациента и подбора оптимальной биотерапии. Онколитическая биотерапии до сих пор в нашей стране не дошла до клинике, что обуславливается, в частности, непредсказуемостью лечебного эффекта, вызванного индивидуальными особенностями опухолей. Внедрение аналитической системы позволит с большой надежностью предсказывать терапевтический ответ, что выведен онколитическую биотерапию на качественно новый уровень.
После успешного завершения проекта созданная аналитическая система, новые выявленные биомаркеры, тесты основанные на них, а также новые варианты онколитических вирусов будут предметом для доклинических и клинических испытаний. Заинтересованность в поддержке таких испытаний имеются у Онкологического института им. Герцена и НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко. Индустриальный партнер - НПО Микроген заинтересован в налаживании производства препаратов разрабатываемых нами онколитических вирусов и реагентов для диагностики восприимчивости опухолей к биотерапии.
В ходе реализации задач проекта в ИМБ РАН будет существенно усилена материально-техническая база для фундаментальных исследований проблем вирусного онколиза, а также для проведения доклинической фазы испытаний терапевтических и диагностических препаратов.

Текущие результаты проекта:
В ходе еще незавершенного первого этапа выполнения проекта нами была проведена теоретическая работа по выбору оптимальной стратегии исследований, а также проведены патентные исследования. Проводится обобщение научной литературы по проекту с целью написания тематических обзоров по теме предстоящей работы, которые послужат ориентирами для наиболее эффективной тактики исследований. В виду большого разнообразия видов злокачественных заболеваний, которые являются предметом исследований, проводится отработка оптимальных и специализированных для каждого типа заболевания процедур забора операционного и биопсийного материала, методов дезинтеграции опухолевых клеток, получения срезов для последующего создания органных культур. Разработаны критерии для формирования коллекции образцов опухолей, пригодной для проведения траскриптомного анализа и приготовления органных культур злокачественных опухолей. Отрабатываются экспериментальные условия для криоконсервирования образцов опухолей различного гистогенеза, которые обеспечат максимальную выживаемость опухолевых клеток после размораживания. Отрабатываются условия для поддержания жизнеспособности органных культур в течение 3-5 суток, т.е. времени, необходимого для репликации вирусов. Проведено клонирование нескольких штаммов онколитических вирусов, которые будут использованы в проекте, с целью создания стандартных моделей. Эти штаммы готовятся для секвенирования генома и испытания репликативной способности на модельных культурах клеток.