Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка прототипов генетических конструкций для коррекции митохондриальных дисфункций и методов их введения в клетки

Докладчик: Исакова Елена Павловна

Должность: старший научный сотрудник, старший научный сотрудник

Цель проекта:
1. Разработка структуры генетической конструкции на основе природной митохондриальной ДНК человека, реплицирующейся в клетках дрожжей Yarrowia lipolytica для коррекции митохондриальных дисфункций человека: митохондриальная миопатия с молочно-кислым ацидозом и инсультоподобными эпизодами (MELAS) и миоклональная эпилепсия с синдромом рваных красных волокон (MERRF). 2. Разработка метода доставки генетической конструкции в митохондрии при помощи использования гомологичной рекомбинации с целью дальнейшей коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF. 3. Разработка методики оценки эффективности действия разработанной генетической конструкции, предназначенной для коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF с помощью новой клеточной модели на основе дрожжей Yarrowia lipolytica.

Основные планируемые результаты проекта:
1.Получение конструкции для введения в клетки Y. lipolytica гена белка RecA бактериального
происхождения, транскрипт которого содержит адресные последовательности митохондриальной
локализации (SOD-5’UTR и SOD-3’UTR).
2.Разработка системы для количественной оценки уровня продукции белка RecA бактериального
происхождения в клетках Y.lipolytica.
3.Получение штамма Y.lypolytica, продуцирующего белок RecA бактериального происхождения с
митохондриальной локализацией, обеспечиваемой за счет лидерных последовательностей транскрипта.
4.Оценка общего уровня продукции белка RecA в рекомбинантных клетках Y.lypolytica.
5.Изучение уровня накопления белка RecA в митохондриях рекомбинантных клеток Y.lypolytica.
6.Создание тест-системы для количественной оценки доли трансформантов, несущих вставку в
митохондриальный геном на принципе метагеномного анализа.
7.Получение синтетического гена устойчивости к гигромицину, по кодоновому составу и организации
старта трансляции адаптированного для экспрессии в митохондриях Y.lypolytica.
8.Получение генетической конструкции в форме линейной двунитевой ДНК для введения в состав
митохондрального генома Y.lipolytica путем гомологичной рекомбинации с 3’-UTR оперона 1.
9.Получение трансформантов. Оценка эффективности введения линейной ДНК-конструкции в
митохондриальный геном.
10.Наработка экспериментального образца ДНК-конструкций.
11.Получение генетической конструкции в форме линейной двунитевой ДНК для инактивации генов Leu и
Lys-специфичных тРНК в составе митохондрального генома Y.lipolytica путем гомологичной
рекомбинации с отбором по устойчивости к гигромицину.
12.Получение трансформантов. Оценка эффективности введения линейной ДНК-конструкции в
митохондриальный геном.
13.Изучение жизнеспособности и отработка методики поддержания рекомбинантного штамма Y.lipolytica с
дефектом в генах Leu и Lys-специфичных тРНК.
14.Получение трансформантов Y. lypolytica, несущих полноразмерный митохондриальный геном человека
с отбором трансформантов по восстановлению аэробного метаболизма.
15.Изучение стабильности эндогенного митохондриального генома при пассировании клеток
трансформантов в условиях аэробного и анаэробного метаболизма.
16.Изучение стабильности экзогенного митохондриального генома при пассировании клеток
трансформантов в условиях аэробного и анаэробного метаболизма.
17.Разработка метода доставки генетической конструкции в митохондрии, метода оценки эффективности
доставки генетической конструкции в митохондрии и метода оценки эффективности действия
генетической конструкции, предназначенной для коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и
MERRF.
18.Разработка метода количественной оценки уровня стабильности митохондриального генома человека
при репликации в клетках Y.lypolytica.
19.Разработка лабораторного регламента получения генетической конструкции для коррекции
митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF.
20.Исследовательские испытания генетической конструкции для коррекции митохондриальных
дисфункций MELAS и MERRF по разработанной программе и методикам испытаний.

Ожидаемые результаты
1.Образец генетической конструкции, обеспечивающей возможность гомологичной рекомбинации в
митохондриях, за счет введения в них бактериальной рекомбиназы RecA. Введение в митохондрии должно
достигаться за счет использования адресных последовательностей транскрипта, взятых из 5’-UTR и 3’-UTR
гена SOD2 (железно-марганцевая митохондриальная супероксиддисмутаза – NCBI GenBank Locus tag
RP1-56L9.2), обеспечивающих локализацию мРНК на внешней поверхности митохондрий.
2.Линия клеток Y.lipolytica, с направленно инактивированными генами Lys и Leu-специфичных тРНК
(соответствует мутациям 3243A→G и 8344A→G в митохондриальном геноме человека), и лишённая за
счет этого аэробного метаболизма, пригодная для отбора клонов с реплицирующимся митохондриальным
геномом человека.
3.Методика тестирования интактности эндогенного митохондриального генома Y.lipolytica в условиях
корепликации с митохондриальным геномом человека.
4.Методика тестирования интактности экзогенного митохондриального генома человека в клетках
Y.lipolytica в условиях корепликации с митохондриальным геномом человека и селекции на
комплементацию нарушенной функции Lys и Leu-специфичных тРНК, приводящей к нарушению
аэробного метаболизма.
5.Образец генетической конструкции, способной импортироваться в митохондрии и супрессировать
мутации 3243A→G и 8344A→G в митохондриальном геноме человека

Возможные пути и необходимые действия по доведению до потребителя ожидаемых результатов

Основным способом коммерциализации разработки будет служить передача прав на ее коммерческую
эксплуатацию индустриальному партнеру головного исполнителя – ООО «ЭдиВак» - компании,
специализирующейся в области биомедицинских исследований и разработок.
Предприятие имеет богатый опыт запуска в разработку ДНК-вакцин против социально-значимых
возбудителей: полиомиелита, энтеровирусов, жёлтой лихорадки, лихорадки Денге и других. Ведущие
специалисты и руководство ООО «ЭдиВак» хорошо знакомо с проблемой митохондриальных болезней
человека, вызываемых наследственными и соматическими перестройками генома митохондрий, и не
нуждается в дополнительной аргументации социально-экономической и чисто коммерческой значимости
этой проблемы. Поэтому основным требованием для этого является современный научно-методический,
научно-технический уровень разработок, а также безопасность для пациента. Доклинические
биологические, микробиологические, иммунологические, токсикологические, фармакологические,
физические, химические и другие исследования разрабатываемых конструкций должны проводиться с
применением научных методов оценок в целях получения доказательств безопасности и эффективности
вакцины и соответствовать требованиям и правилам надлежащей лабораторной практики. Исследования и
результаты должны соответствовать поставленным целям и задачам, базироваться на достоверных данных
и источниках информации. Исполнители, привлекаемые к работам, должны иметь соответствующую
квалификацию и компетенцию.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Области применения, способы использования результатов

Разрабатываемая система пригодна для разработки системы генной терапии любых митохондриальных
болезней человека, включая и гомопластические. Основным направлением применения являются
заболевания с доминированием миопатической составляющей: митохондриальной миопатии с молочно-
кислым ацидозом и инсультоподобными эпизодами (MELAS) и миоклональной эпилепсии с синдромом
рваных красных волокон (MERRF), поскольку в случае этих заболеваний существует возможность
введения клеток-предшественников с откорректированным митохондриальным геномом непосредственно
в пораженные мышцы. В перспективе возможно расширение спектра поддающихся лечению
митохондриальных болезней за счет нейродегенеративных заболеваний ЦНС, зрительного нерва и улитки,
для чего новая технология должна быть применена для коррекции генома стволовых или полустволовых
клеток-предшественников, пригодных для временного поддержания в культуре. Конкретными решениями,
пригодными для внедрения в практику, являются следующие:
1.Создание неограниченного источника получения интактной хромосомной ДНК конкретного пациента за
счет её поддержания, селекции и контроля в клетках Y.lipolytica.
2.Создание возможности направленной модификации генома митохондрий человека, реплицирующегося за
счет собственных элементов в митохондриях Y.lipolytica в условиях селективного давления системы
комплементации активности Lys и Leu-специфичных тРНК (соответствует мутациям 3243A→G и
8344A→G в митохондриальном геноме человека) при наличии системы гомологичной рекомбинации,
функционирующей за счет искусственно введенного в митохондрии бактериального белка RecA.
3.Создание системы мониторинга за интактностью генома человека при корепликации в митохондриях
дрожжей совместно с их собственным эндогенным геномом.
Возможные потребители ожидаемых результатов
Конечными потребителями предлагаемой к разработке продукции могут являться медико-генетические
центры России и других стран, а также научно-технологические фирмы, специализирующиеся в области
молекулярной диагностики. Однако, использование результатов ПНИ возможно только по окончании
стадии доклинических и клинических испытаний, а также при условии разработки надёжных средств
диагностики митохондриальных мутаций, учитывающих склонность их генома в интенсивному
соматическому мутагенезу, включая делеционный, что может приводить к существенным генетическим
различиям митохондрий в различных тканях пациента.


Текущие результаты проекта:
1. Сделан аналитический обзор информационных источников.
2. Проведены патентные исследования
3. Проведена сравнительная оценка эффективности возможных направлений исследований:исследование возможных механизмов
доставки разрабатываемой генетической конструкции в митохондрии и теоретическое обоснование структуры
предлагаемой к разработке генетической конструкции для практического решения задач по коррекции митохондриальных
дисфункций MELAS и MERRF.
4. Разработана конструкция для введения в клетки Y. lipolytica гена белка RecA бактериального происхождения,
транскрипт которого содержит адресные последовательности митохондриальной локализации (SOD-5’UTR и SOD-3’UTR).
5. Разработана конструкция для проведены работы по созданию прототипов генетических конструкций для коррекции митохондриальных дисфункций и методов их введений в клетки.