Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка многофункционального биопестицида для защиты растений от патогенов и вредителей

Докладчик: Максимов Игорь Владимирович

Должность: заведующий лабораторией

Цель проекта:
1.1. Создать многофункциональный биопрепарат на основе консорциума, включающего, в том числе эндофитный штамм бактерий, и сочетающий в себе высокую пестицидную активность по отношению к вредителям и болезням, защитную по отношению к растениям от стрессов абиотической природы. 1.2. Проект направлен на создание высокоэффективного многофункционального биопестицида нового поколения на основе эндофитных штаммов микроорганизмов из рода Bacillus, обладающих высокой экологической безопасностью (4-й класс опасности), препаративной стабильностью, иммуномодулирующей и антистрессовой активностью в отношении растений, а также биоцидной активностью против патогенов и вредителей. Проект предусматривает отбор из коллекции известных штаммов бактерий рода Bacillus, адаптированных для совместного роста в тканях растений в условиях Южного Урала и на их основе создать комплексный препарат. Предполагается, что препарат наряду с целевыми биоцидными свойствами будет обладать способностью подготавливать геном растений к формированию последующей устойчивости к неблагоприятным факторам среды. В перспективе планируется создание рекомбинантной формы эндофитной бактерий сочетающей в себе все вышеперечисленные свойства.

Основные планируемые результаты проекта:
2.1. Проведен обзор научно-технической литературы по тематике ПНИ, и на его основании проведен выбор разрабатываемого направления. Проведены патентные исследования по поиску подобных биопрепаратов и проведены разработки по обнаружению прототипов для создания экспериментального образца. Определены основные виды бактерий в качестве безопасных, эффективных и коммерчески выгодных основ биопрепаратов. Таковыми признаны виды Bacillus subtilis и Bacillus thuringiensis. Определены основные наиболее вредоносные возбудители болезней и насекомые вредители для яровой пшеницы и картофеля и разработан план проведения ПНИ по оценке биологической эффективности применения биопрепарата против них. Проведен подбор эффективных комбинаций эндофитов для получения многофункционального препарата. С этой целью заложены полевые опыты на посевах яровой и озимой пшеницы, а также картофеля. Установлено, что в качестве основного компонента многофункционального биопрепарата предпочтительно использовать эндофитные штаммы бактерий вида B. subtilis. В настоящее время оценивается влияние базовых образцов биопрепаратов на урожайность культур и качество продукции. Идет анализ оптимальных условий культивирования микроорганизмов и технологий получения сухих форм бактерийных препаратов, в том числе на основе разработок индустриального партнера. Проведена оценка фунгицидной и инсектицидной активностей штаммов бактерий B. subtilis и B. thuringiensis против септориоза пшеницы и фитофтороза картофеля, а также против колорадского жука. Изучена антагонистическая активность бактерий по отношению к микрофлоре кишечника жесткокрылых на примере колорадского жука. Проведены исследования по подбору оптимальных условий культивирования штаммов микроорганизмов для наработки экспериментальных образцов биопрепарата. Определен состав сред, параметры температуры, аэрации, скорости перемешивания. В результате проведенных ПНИ получены прототипы экспериментальных образцов многофункционального биопрепарата для защиты картофеля и пшеницы. Разработана методика тестирования эффективности препарата против возбудителей болезней и вредителей пшеницы картофеля и подобраны маркеры для более эффективной оценки. Проведен поиск наиболее устойчивых и восприимчивых к патогенам сортов пшеницы, а также поиск маркерных генов для последующего анализа их ответных реакций на инфицирование. Показано, что наиболее восприимчивым к септориозу является сорт Казахстанская 10, а наиболее устойчивым - Омская 35. Выявлено, что наибольшей чувствительностью к инфицированию патогенами обладают ферменты оксидоредуктазного ряда, в частности пероксидаза. В целях популяризации исследований участники гранта – сотрудники ИБГ УНЦ РАН и индустриального партнера ООО НВП «БашИнком» дали совместное интервью корреспонденту телекомпании «Башкирское спутниковое телевидение». Кроме того, участники соглашения участвовали в ряде конференций международного и всероссийского масштаба на территории Российской Федерации (Межд. научная конф. «Генетические ресурсы растений - основа продовольственной безопасности и повышения качества жизни», С.-Петербург. 6-8 октября 2014 г.; Всероссийская конференция с международным участием, посвященной памяти профессора Киреевой Н.А. «Биотехнология – от науки к практике». Уфа. 2014. 23-26 сентября 2014 г.; VII Всероссийский с международным участием конгресс молодых ученых-биологов Симбиоз-Россия. Екатеринбург. 6-9 октября 2014; II Всероссийская молодёжная научная школа-конференция «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах», Оренбург. 22-24 сентября 2014 г.) с презентациями отдельных фрагментов ПНИ. Индустриальный партнер ООО НВП «БашИнком» способствует эффективному проведению исследований путем материального и технического обеспечения наиболее трудоемких работ.
2.2. Биопрепарат будет иметь следующие технологические характеристики: Область применения – растениеводство. Целевые объекты – пшеница, картофель. Препаративная форма – жидкость, порошок. Расход для обработки 1 тонны семян – не более 2 л (кг). Расход для обработки посевов – не более 4 л (кг) на 1 га. Препарат будет эффективен против спектра патогенов и вредителей пшеницы и картофеля, а также обладать антистрессовой активностью. Комплексный многофункциональный биопестицид обеспечит профилактику и защиту, в т.ч. от вредителей и болезней, на уровне и выше существующих биопрепаратов и на уровне химических пестицидов: зерновых культур - от корневых гнилей, септориоза, злаковой тли, картофеля - от колорадского жука, фитофтороза.
2.3. В настоящее время использование микроорганизмов, с одной стороны, характеризующихся явной фитоиммуномодулирующей активностью, а с другой, генами инсектотоксичных белков, является распространенным способом улучшения действия биоинсектицидов. Однако при этом не всегда учитываются такие полезные свойства микроорганизма как его эндофитность, антагонистическая способность, а также способность пролонгировано индуцировать защитные системы растений. Нами планируется использовать эндофитные штаммы Bacillus, обладающие высокой рост-регулирующей и фитоиммуномодулирующей активностью, что позволит создать биопрепарат, обладающий комплексными хозяйственно-полезными признаками. Новым следует считать и планируемый к созданию рекомбинантый штамм B. subtilis на базе эндофитного штамма B. subtilis 26Д, содержащий экспрессирующийся в бактериальных клетках вектор с геном инсектотоксичного белка.
2.4. Современная культура растениеводства немыслима без применения систем защиты растений, поскольку обеднение генофонда культурных растений ускоряет подбор патогенами и вредителями «ключей» к их фитоиммунной системе. Несомненно, самым простым и наиболее активно используемым, особенно в последнее столетие, методом борьбы с болезнями и вредителями, а заодно и с сорняками на полях являются химические средства защиты растений (ХСЗР), моментально уничтожающие нежелательного объекта. По данным глобального исследования компании Клеффманн Груп, объем мирового рынка пестицидов в 2013 г. оценивался в 57,2 млрд долл. В 2014 г. он может достигнуть 60 млрд. долл., пишет американский журнал Farm Chemicals International (цит. по Насонова, 2014). Причем, обращает на себя внимание то, что прогноз повышения уровня использования ХСЗР затрагивает, наряду со странами Юго-Восточной Азии, и Россию. Вопрос об экономичности разработок новых пестицидов при возрастающих требованиях биологической и экологической безопасности в настоящее время и в дальнейшем будет решаться на основании компромиссов в системе “экономики и безопасности” [Захаренко, 2014]. Интенсивное применение ХСЗР в сельском хозяйстве вступило в настоящее противоречие с проблемой защиты окружающей среды, что заставляет искать и использовать вместо сильнодействующих химических средств защиты растений против патогенов и вредителей соединений иной природы, экологически приемлемых и не оказывающих вредного воздействия на человека и окружающую среду в целом. К таким соединениям следует отнести низкомолекулярные вещества биологического или синтетического происхождения, способные стимулировать иммунный потенциал растений. Их применение является новым направлением в системе защиты растений.
Еще одной группой следует считать препараты, действующим началом которых являются живые культуры микроорганизмов (бактерий, грибов), обладающие целым спектром «полезных» признаков, среди которых можно отметить их явный антистрессовый и антипатогенный эффект и регуляция роста растений [Новикова, 2005; Pieterse et al., 2007; Bakker et al., 2007; Barruiso et al., 2008; Ongena, Jacques, 2008; Saunders, Kohn, 2009; Мan der Lelie et al., 2009]. Ещё на заре развития биометода было показано, что бактерии-антагонисты стимулируют рост растений и могут одновременно защищать их от стрессов биотической и абиотической природы [Казарян, Агаджанян, 1971]. Эти работы сейчас нашли продолжение в довольно обширном потоке исследований, в том числе и обзорных работах, посвящённых регулирующим рост растений ризобактериям (в переводе plant growth promoting rhizobacteria, PGPR), роль которых в регуляции защитной системы растений многофункциональна [Reva et al., 2004; Compant et al., 2005; Pieterse et al., 2007; Van Loon, 2007; Мелентьев, 2007; Романенко и др., 2008; Berg, 2009; Wu et al., 2009; Максимов и др., 2011; Kumar et al., 2012]. В растениях под влиянием PGPR запускаются свои собственные механизмы защитной системы, обозначенные как «системная индуцированная устойчивость» (СИУ) (induced systemic resistance (ISR)) и «системная приобретенная устойчивость» (СПУ) (systemic acquired resistance (SAR)) [Van Loon, 2007; Conn et al., 2008; Barruiso et al., 2008; De Vleesschauwer et al., 2008].
Экологичность биопрепаратов способствует активному внедрению технологии их использования в сельскохозяйственную практику. С одной стороны, производители, а также потребители, заинтересованы в получении экологически чистой продукции, что инициируется как самим населением, приобретающим продукты питания, так и стимулируется дотациями со стороны органов власти. Так, официальные власти в странах ЕС с 2007 г. предлагают значительно ограничить содержание химических препаратов в среде обитания человека и использовать интегрированную систему защиты растений, сочетающую в себе химические методы борьбы с биологическими. Анализ общего рынка биопрепаратов показал, что, например, в 2004 г. он составлял примерно 588 миллионов долларов [Bolckmans, 2008], из которых на долю Северной Америки приходилось 240-260 млн. $ [http://www.abercade.ru/research/analy-sis/3194.html]. После США второе место в мире по производству биопестицидов занимает Китай, где расположено 200 заводов, производящих 77 зарегистрированных биопестицидов, применяющихся на более чем 30 млн. га. C 1986 г. мировая выработка биопрепаратов поднялась в среднем с 5% до 20% от общего объема производимых средств защиты растений и составляет в Северной Америке около 43.5%, в Европе – 20.7%, в Азии – 12.2%, в Океании – 11.2%, в Латинской Америке – 8.3% и в Африке – 3.9%. Хотя на современном этапе биологические меры борьбы с патогенами и фитофагами в России находятся в довольно неразвитом состоянии, по заключению экспертов, уже к 2012 году они и в наших условиях «должны стать конкурентоспособными с химическими пестицидами» [Монастырский, Першакова, 2009]. Поставлена задача, чтобы от всего объема средств защиты растений не менее 10% занимали средства защиты растений на основе живых бактерий или же их метаболитов.
Выявлено, что большинство растений в природе находится в ассоциативном взаимодействии с окружающей средой и, в частности, с ризосферной и филосферной микрофлорой. Условно PGPR можно разделить на три группы [Gray, Smith, 2005]. В первую группу следует отнести свободноживущие почвенные формы, при благоприятных условиях вступающие в случайные ассоциации с растениями. Вторая группа - ризосферные и филосферные виды, заселяющие поверхность и перифирию корней или эпидермиса надземных органов растений. И к третьей группе следует отнести PGPR, формирующие с тканями и органами растений прочные ассоциации, проникая в них по межклетникам (эндофиты). Часто представители последней группы не могут существовать долговременно вне живых тканей хозяина или теряют свои «полезные» свойства при долговременном культивировании в неассоциированном с растениями состоянии. Важно заметить, что эта группа часто адаптирована к сосуществованию с определенной родовой и видовой, а иногда и конкретно-местной сортовой растительной популяцией, наподобие ризобиальных бактерий, ассоциированных к симбиотическому существованию на конкретных сортах и видах бобовых. Последняя группа PGPR привлекает внимание исследователей, как перспективная для повышения продуктивности сельхозкультур.
Из ризосферы, а также из тканей различных органов (преимущественно корней) многих растений выделены штаммы PGPR, идентифицированные как ризобиальные (Rhizobia), диазотрофные (Azospirillium, Azoarcus, Aziviobria), бациллярные (Bacillus), псевдомонадные (Pseudomonas), актиномицетные (Streptomyces) [Мелентьев, 2007; Van Der Lile et al., 2009]. Так, из растений тополя выделены эндофитные штаммы Methylobacterium populi BJ001, способные минерализовать нитрозозамещенные взрывчатые вещества, например, тринитротолуол [Van Aken, 2004]. Сто двадцать один морфологочески различающийся бактериальный изолят, распределенный впоследствии в 21 группу, был выделен из двух сортов гибридного тополя (Populus trichocarpa x P. deltoides cv. “Hazendans”и “Hoogvorst”), Среди изолятов доминировали виды Pseudomonas (42%), в меньшей степени Xanthomonas spp., Acinetobacter spp. и Enterobacter spp. Кроме того, обнаружены виды Burkholderia spp. (10%) and Herbaspirillum spp. (4%), Sphingomonas spp. (9%). Грамположительные бактерии представляли 13% от всего числа изолятов и состояли из видов родов Arthrobacter spp. (10%), Bacillus spp., Paenibacillus spp., и Agreia spp [Porteous Moore et al., 2006; Ulrich et al., 2009].
Важным преимуществом ряда PGPR является их способность повышать адаптивный потенциал растений. Обнаружено, что бактерии, в особенности эндофитные виды и штаммы, могут усиливать устойчивость растений к различным факторам окружающей среды. Их защитное действие связано со способностью продуцировать: а) антибиотические соединения пептидной и низкомолекулярной природы; б) различные сидерофоры и хелаторы, способствующие усилению усвояемости растениями макро- и микроэлементов, в том числе кальция, железа или, напротив, изолирующие тяжёлые металлы или токсические органические вещества, в том числе вырабатываемые и патогенами; в) вещества, переводящие фосфор из нерастворимого состояния в растворимое, а также, усиливающие способность других азотфиксирующих бактерий фиксировать атмосферный азот; г) ферменты, деградирующие клеточные стенки патогенов (хитиназы, β-1,3-глюканазы), а также их токсины; д) регуляторы роста и различные сигнальные молекулы (ауксины, гиббереллины, цитокинины, абсцизовую, салициловую кислоты и жасмонаты); е) ферменты, регулирующие синтез этилена в растениях и др.
Особо привлекательными для промышленного (коммерческого) производства различных биопрепаратов для защиты растений являются штаммы бактерий из рода Bacillus [Мелентьев, 2007]. Среди выделенных из тканей здоровых растений хлопчатника (Душанбе, Таджикистан) 76-и штаммов спорообразующих бактерий преобладал Bacillus subtilis [Reva et al., 2002]. Замечено снижение степени колонизации корней хлопчатника грибами рода Fusarium и, соответственно, ослабление вилта при обработке эндофитными штаммами B. subtilis, выделенными из этой культуры [Reva et al., 2002]. На основе одного из штаммов B. subtilis 26Д создан препарат Фитоспорин-М, эффективный против плесневения и гнилей семян различных культур, черной ножки, фитофтороза, альтернариоза картофеля и способный непосредственно воздействовать на ростовые характеристики патогенов [Список пестицидов…, 2008]. Из здоровых тканей пшеницы были выделены три штамма Bacillus ssp. и несколько видов грибов [Larran et al., 2002]. Исследователями из КНР выделены 221 бактериальный, 34 грибных и 5 актиноризных изолята из листьев и корнеплодов сахарной свеклы [Shi et al., 2009]. На основе австралийской линии А-13 бактерии B. subtilis получена новая перспективная линия GB03, зарегистрированная в 1985 году фирмой Uniroyal Agricultural Chemical (США), проявляющая высокую антагонистическую активность на посевах хлопчатника и арахиса по отношению к Rhizoctonia solani, F. oxisporium f.sp. vasinfectum. На основе другой линии GB07 этого же штамма бактерии создан препарат, эффективный против патогенов рода Pythium на хлопчатнике. Защитная эффективность бактерии B. subtilis FZB-24 на растениях спаржи и картофеля была высокой по отношению к патогенам F. oxysporium Schlecht, Streptomices scabies, Erwinia carotovora ssp. atroseptica [Kilan et al., 2000]. Препарат Бациспецин БМ на основе B. subtilis 739 использовался для подавления развития корневых гнилей, аэрогенных инфекций (желтая, бурая и стеблевая ржавчины) на посевах пшеницы, где его эффективность действия не уступала химическим пестицидам [Мелентьев и др., 2006]. Применение препарата Бактофит на основе штамма B. subtilis ИПМ-215 снижало развитие корневых гнилей озимой пшеницы до 4-х раз и поражение мучнистой росой до 10-и раз. Обнаружена стимуляция роста растений и антагонизм в отношении M. incognita при их обработке бактериальными штаммами B. cereus S-18, B. subtilis VM-1-32 и Pseudomonas sp. W-34. При обработке семян пшеницы биосредствами снижалась зараженность возбудителями корневых гнилей на 20.9 - 51.2%, а возбудителями листо-стебельных болезней – на 24.3 - 63.5%. Величина сохранённого урожая доходила, например, у пшеницы, томатов, яблони до 20-25%, кукурузы и картофеля – до 20%, ячменя, люцерны и хлопчатника – на 15%, капусты – на 10%, а биологическая эффективность до 50.5 - 96.4%. [Романенко и др., 2008].
Имеются сообщения о способности некоторых штаммов Bacillus контролировать развитие головневых, например Tilletia caries and T. levis, в злаках [Kollmorgen, Jones, 1968; Кузьмина и др., 2003; Хайруллин и др., 2009]. Штамм B. subtilis 11РН проявлял эффективность подобно тебуканазольным фунгицидам [Хайруллин и др., 2009]. Защитный эффект B. subtilis 26Д и Paenibacillus ehimensis IB-739 против твердой головни на растениях пшеницы доходил до 60-70% [Кузьмина и др., 2003).
Отдельно следует обсудить возможность использования PGPR в защите растений от насекомых и нематод. Так известны данные об участии штаммов Bacillus cereus AR156 (Wei et al., 2010), B. thuringiensis (Dipel® biopreparation), B. megaterium и B. subtilis (Khalil, 2013) в защите растений томата от галловой нематоды Meloidogyne incognita. Лечебный эффект в некоторых случаях достигал 78% (Khalil, 2013). Обнаружено, что свойство сдерживать развитие вируса мозаики огурца на растениях томата изолятом B. subtilis ВS3A25 опосредовано способностью этого штамма угнетать развитие переносчика этого заболевания – бахчевой тли Aphis gossipi [Shudhakar et al., 2011].
Особый интерес среди положительных свойств эндофитных бактерий уделяется индуцированию фитоиммунитета против патогенов и вредителей, поскольку является важной составляющей для последующего обоснования эффективности их применения в сельскохозяйственной практике. Механизмы распознавания и развития защитных реакций с участием эндофитов пока остаются слабо исследованными. В 1991 г. три исследовательские группы [Alstrom, 1991; Van Peer et al., 1991; Wei et al., 1991] независимо друг от друга обнаружили, что вызываемая бактериями рода Pseudomonas устойчивость растений к патогенам является специфической и отличается от СПУ, вызываемой салициловой кислотой и элиситорами. Причем, в некоторых растениях при совместном развитии и СПУ и СИУ часто наблюдают их интерференцию, что проявляется в слабой эффективности применяемого биопрепарата [Pieterse et al., 2007; De Vleesschauwer et al., 2008].
Инокуляция PGPR повышала устойчивость растений к различным заболеваниям [Gwinn et al., 1998; Kelemu et al., 2003; Недорезков, 2003] и абиотическим стрессовым факторам [Redman et al., 2002; Bultman et al., 2004; Campanile et al., 2007; Popay, 2009; Saunders, Kohn, 2009]. PGPR индуцирует СИУ против широкого спектра патогенов, включая оомицеты, грибы, бактерии и вирусы (Van Loon et al. 1998), и даже насекомые (Van Oosten et al. 2008) во многих видах двудольных растений, таких как арабидопсис, фасоль, морковь, эвкалипт, табак, томаты и редис (Kloepper et al. 2004; Bakker et al. 2007; Van Wees et al. 2008), а также однодольных – рис, кукуруза и пшеница (Rosenblueth and Martines-Romero 2006; De Vleesschauwer et al. 2008).
PGPR дифференцированно повышали чувствительность генов, вовлеченных в СПУ или СИУ, при последующем инфицировании патогенами [Ryu et al., 2004; Verhagen et al., 2004; Conn et al., 2008; Yang et al., 2009; Valenzuela-Soto et al., 2010]. Серия работ по скринингу наиболее чувствительных к PGPR генов обнаружила быстрое реагирование около 200 растительных генов, среди которых часть снижала, а часть (в соотношении 1:1), напротив, многократно повышала свою активность [Pozo et al., 2008; Yang et al., 2009; Valenzuela-Soto et al., 2010]. Причем, экспрессия 70% генов под влиянием PGPR была связана с СИУ, 13% зависима как от СИУ, так и СПУ, а 17% генов регулировалась дифференцированно. Например, в формировании устойчивости растений перца к бактериальной гнили Xantomonas axonopodis pv. vesicatoria под влиянием штамма B. cereus BS107 вовлеклись гены защитных белков, часть которых, например, pR-1 индуцируется салициловой кислотой, часть (pR-4, pR-10) - жасмоновой кислотой и этиленом, а часть - Н2О2 [Yang et al., 2009]. Обнаружен ключевой транскрипционный фактор MYC2, чувствительный к жасмоновой кислоте, включающийся в сенсибилизацию растительных тканей против ряда патогенов и насекомых [Pozo et al., 2008].
Штаммы В. subtilis GB03 и B. amyloloquefaciens IN937a, а также выделенный из тканей пшеницы штамм Streptomyces sp. EN28 индуцировали СИУ арабидопсиса против бактериального патогена E. carotovora ssp. carotovora [Ryu et al., 2004; Conn et al., 2008; Choudhary, Johri, 2009]. Штамм В. subtilis BEB-DN индуцировал в растениях томатов экспрессию генов, связанных с СИУ, и формировал устойчивость растений к насекомым [Valenzuela-Soto et al., 2010]. Под влиянием штамма P. fluorescens WCS417r происходила активация генов СИУ и усиливалась устойчивость растений к Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, Xantomonas campestris pv. armoraciae, E. car. subsp. cartovora, F. oxysporium f sp. raphani, Alternaria brassicola, Botritis cinerea и Hyaloperonospora parasitica [Pieterse et al., 2007]. Подобное развитие событий происходило в растениях арабидопсиса под влиянием эндофитного гриба Penicillium simplicissimum GP17-2 и его культурального фильтрата при формировании защитной реакции против патогенной бактерии P. syringae pv. tomato DC3000 [Hossain et al., 2007]. В то же время индукция устойчивости к оомицету Hyaloperonospora parasitica, двум аскомицетам Botrytis cinerea, Alternaria brassicicola и бактерии P. syringae pv. tomato DC3000 под влиянием эндофитного гриба Penicillium chrysogenum не зависела как от салициловой кислоты, так и жасмонат/этиленового сигнального пути [Thuerig et al., 2006]. Штаммы P. fluorescens СНА0 и P. aeruoginosa 7NSK2 индуцировали СИУ в растениях винограда к B. cinerea, запуская механизмы окислительного взрыва и синтеза фитоалексинов [Verhagen et al., 2010]. В серии работ лаборатории Van Loon (Utrecht, Нидерланды) с использованием мутантных по синтезу жасмоновой кислоты и этилена растений арабидопсиса было доказано, что формирование СИУ под влиянием PGPR сопряжено с этиленом [Pieterse et al., 2007]. Причем, если в корнях этиленовый сигнал вызывал локальное развитие защитных реакций в зоне инфицирования, то в надземной части происходила системная сенсибилизация генов СИУ [Van Loon, 2007]. В связи с отмеченными результатами интересны данные о способности некоторых штаммов Bacillus и Pseudomonas снижать синтез этилена, за счет продукции деаминазы АСС (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid), ключевого соединения – предшественника этого гормона [Ghosh et al., 2003; Sziderics et al., 2007; Pieterse et al., 2007]. Этилен, являясь гормоном-стресса, включается в индукцию СИУ совместно и последовательно с жасмоновой кислотой. Низкие концентрации бактериальных деаминаз АСС могут способствовать активации роста корней растений [Glik, 2005]. Показано, что защитный ответ растений, индуцированный P. fluorescens WC417r и LSW17S, а также бактерий рода Bacillus независим от СПУ, что проявляется в отсутствии и даже ингибировании транскрипционной активности генов, сопряженных с ней, и ассоциирован с СИУ [Kloepper et al., 2004; Pieterse et al., 2007; Liu et al., 2008]. Однако следует отметить, что один из важных транскрипционных факторов СИУ, запускаемой бактериями Pseudomonas MYB72, характеризовался нечувствительностью к этилену, но для его эффективной работы при запуске жасмонатной сигнальной системы требовался кофактор, уровень которого регулируется этиленом [Van der Ent et al., 2008].
Штамм Bacillus vallismortis EXTN-1, обладающий высокими элиситорными свойствами на многих культурах, показал эффективность на огурцах и запускал экспрессию генов pR-1 [Park et al., 2009]. Экспрессия ряда генов СПУ, наряду с генами СИУ обнаруживалась и в патогенной системе перец – X. axonopodis pv. vesicatoria под влиянием B. cereus BS107 [Yang et al., 2009]. Устойчивость арабидопсиса к грибу F. oxysporum придавалась штаммами актиномицетов Micromonospora sp. EN43 и Streptomyces sp. EN27 через активацию генов СПУ [Conn et al., 2008]. Соответственно, СПУ, запускаемая штаммом Streptomyces sp. EN27, была зависимой от белка NPR1, тогда как под влиянием штамма Micromonospora sp. EN43 - независимой. Путем изменения состава среды культивирования авторы показали, что на минимальной среде штамм Micromonospora sp. EN43 продуцирует соединения, индуцирующие СПУ, а на комплексной среде – СИУ. Причем, индукция экспрессии защитных маркерных генов с участием этого штамма происходила только в инфицированных растениях, что предполагает важную роль PGPR в сенсибилизации их защитных систем [Verhagen et al., 2004; Pieterse et al., 2007]. Полученные данные указывают на возможность вовлечения в СИУ, запускающуюся эндофитами, генов СПУ, активирующихся под влиянием салициловой кислоты [Pieterse et al., 2007].
Использование генно-инженерных конструкций GUS с промотором гена pR-1, продукт которого накапливался в растениях при СПУ, показал, что эндофитные штаммы Pseudomonas могут индуцировать этот промотор [Park, Kloepper, 2000]. Эти данные интересны в связи с тем, что патогенный штамм бактерии P. syringae pv. tomato индуцирует у растений строго активацию генов СПУ [Van Loon, 2007]. Соответственно, можно считать, что ответная реакция растений на обработку бактерией, в зависимости от его патогенности, а также хозяина может различаться. Так, научной группой под руководством Van Loon [2007] обнаружено, что штамм P. fluorescens WCS374r, индуцирующий на растениях редиса СИУ, был не эффективен на арабидопсисе, а P. putida WCS358r, наоборот. Другой штамм WCS417r эффективный на гвоздике, редисе, томатах и бобах был неэффективен на эвкалипте. Даже внутри вида Arabidopsis thaliana наблюдались значительные отличия между популяциями в ответной реакции растений. Это предполагает высокую степень генетической детерминированности этого признака. Вероятно, при формировании совместимых взаимоотношений между сигнальными и рецепторными системами, как макро, так и микросимбионтов, должны происходить тесные межорганизменные взаимодействия.
Поскольку инфицирование растений PGPR затрагивает сигнальные системы, ответственные за формирование и СИУ, и СПУ, интересны данные о влиянии бактерий на функционирование ключевого белка NPR1, регулирующего в свою очередь активность сигнальной системы СПУ. Согласно работе Pieterse et al., [2007] в мутантах npr1 под влиянием P. fluorescens WCS417r не запускалась СИУ, что предполагает важность белка NPR1 в индукции СИУ и предполагает дифференциальное его вовлечение в сигнальные пути, индуцируемые гормонами и сигнальными молекулами. Выдвигаются также предположения, что активность NPR1 может существенно отличаться в зависимости от его локализации в клеточных компартментах. Например, цитозольная NPR1 запускает СПУ, а ядерная СИУ [Tada et al., 2008]. Виды Bacillus запускают СИУ растений по тому же сценарию, что и Pseudomonas, но также могут элисировать защитные системы, независимые от действия NPR1 белка [Kloepper et al., 2004].
Влияние PGPR на функционирование защитных систем растений подобно реакциям, запускающимся под влиянием истинных патогенов в устойчивых формах [Van Loon, 2007]. Оно обусловлено способностью эндофитов, наряду с разными метаболитами, выделять во внеклеточную среду такие специфические сигнальные соединения [Forchetti et al., 2007; Visca et al., 1993; Shanmugam, Narayanasamy, 2009]. Некоторые компоненты-триггеры, индуцирующие СПУ и СИУ растений под влиянием PGPR, расшифрованы и представляют собой липополисахариды и флагелин клеточных стенок, а также сидерофоры псевдобацин и пиоцеолин, антибиотики пиоцианин и 2,4-диацилфлюроглюцинол, N-ацилгомосеринлактоны и 2,3- бутандиолы [Bakker et al., 2003; Pieterse et al., 2007; Van Loon, 2007; Verhagen et al., 2010].
У растений к ним существуют специфические рецепторы из семейства Toll-подобных белков, содержащих в своей структуре лейцин-богатые домены. Так, рецепция флагелина P. putida WCS358 клетками растений арабидопсиса, томатов и бобов осуществлялась посредством взаимодействия с мембранно-ассоциированными киназами FLS2 (flagelin-sensitive2) [Meziane et al., 2005; Bakker et al., 2007; Choudhary et al., 2009]. Однако флагелин, обладая высокой элиситорной активностью, не всегда запускал защитную реакцию СИУ, не был достаточно эффективным ее триггером у эндофитных форм Pseudomonas [Bakker et al., 2007] и не всегда вовлекался в формирование эндофитных взаимоотношений PGPR с растительными тканями [Gomes-Gomes, Boller, 2002]. Относительно индуцирования СИУ под влиянием липополисахаридов (ЛПС) бактерий показано, что они также как и флагелин, обладали высокой локальной элиситорной активностью в зоне проникновения бактерии. ЛПС, выделенные из Pseudomonas WCS417r, на растениях гвоздики и редиса могли запускать СИУ, эффективную против грибов Fusarium ssp [Bakker et al., 2007]. На картофеле ЛПС обладали высокой триггерной активностью по отношению к Globodera pallida [Reitz et al., 2000]. Но согласно сообщению Dow с сотрудниками [2000] ЛПС Pseudomonas, хотя и являлись тригерами запускающими СИУ, не участвовали в формировании самой СИУ. Причем, запуск СИУ под влиянием ЛПС прямо пропорционально зависит от уровня доступности железа бактерией [Bakker et al., 2007]. Можно предположить, что механизм рецепции как флагелина, так и ЛПС на растения ограничивается определением наличия чужеродного организма в непосредственном контакте с клеткой и инициирования развития неспецифической локальной защитной реакции.
Соответственно, у PGPR должна существовать иная форма индуцирующих СИУ в растениях молекул. В качестве таких молекул могут участвовать специфические индивидуальные для каждого штамма соединения, вырабатываемые и секретируемые во внеклеточную среду, например, пептиды с антибиотическими свойствами, а также универсальные сигнальные молекулы этилен, салициловая и жасмоновая кислоты, выработка которых бактериями доказана [Maurhofer et al., 1998; De Meyer, Hofte, 1999]. Важную роль в запуске эндофитами защитной системы растений играют белки, вырабатываемые бактериями, а также растениями в ответ на инфицирование, обладающие свойствами гидролаз, ацетилаз полисахаридов, оксидаз [Schoonbeek et al., 2007]. Так, в ризосфере были обнаружены бактерии, вырабатывающие оксалат-разрушающие ферменты, посредством которых в прилежащей к корням зоне генерировались антимикробные концентрации Н2О2. Обнаружено, что их использование способствовало повышению почти на 70% степени защиты растений арабидопсиса от патогенов [Schoonbeek et al., 2007]. Иммунизация растений риса псевдобацином P. fluorescens WCS374r способствовала локальному накоплению высоких доз активных форм кислорода, а также фенольных соединений и каллозы в зоне инфицирования патогенным грибом M. oryzae [De Vleesschauwer et al., 2008]. Бактерии Pseudomonas и Bacillus защищали растения от патогенов не только вследствие высокой антифунгальной активности их антибиотиков, но и опосредованной ими индукцией экспрессии преимущественно белков СИУ, накопления в зоне инфицирования фенолов [Saravanakumara et al., 2007], ферментов про-/антиоксидантной системы и продуктов их работы [Govindappa et al., 2010; White et al., 2010]. Бактеризация растений томатов штаммом B. subtilis BEB-DN приводила к экспрессии ряда генов СИУ, среди которых наибольшей активностью характеризовались гены pR-4, pR-6, ингибиторов протеиназ, и ферментов синтеза лигнина, что придавало устойчивость растений к насекомым [Valenzuela-Soto et al., 2010]. Проникновение в корни гороха бактерии B. pumilus SE34 приводило к накоплению каллозы, фенольных соединений и продукта их полимеризации – лигнина [Benhamou et al., 1996]. P. aeruginosa 13 и Pseudomonas aureofaciens 63–28 стимулировали активность фенилаланинаммоний-лиазы в корнях огурцов [Chen et al., 2000], сафлора [Govindappa et al., 2010], а P. putida BTP1 – у томатов липоксигеназы [Akram et al., 2008]. Важно, что обработка PGPR приводила к активации в восприимчивых растениях тех же изопероксидаз, что индуцируются в устойчивых растениях под влиянием патогенов [Chen et al., 2000; Максимов и др., 2010].
Таким образом, эндофитные штаммы PGPR производят сенсибилизацию генома растения при заселении тканей, позволяющую усилить его чувствительность к инфицированию и подготавливают защитную систему растений к последующим ответным реакциям. Важным показателем быстрого формирования системной устойчивости при этом является локальное накопление активных форм кислорода в зоне инфицирования. При этом важно обратить внимание, что эта сенсибилизация, формирует СИУ, нацеленную на защиту растений не только от патогенов, но и абиотических стрессов.
Воздействие избыточных концентраций солей тяжелых металлов (ТМ) на растения привлекает особый интерес исследователей в связи с ростом техногенного загрязнения почв, что отражается не только в уменьшении урожая, но и ухудшении его качества [Белимов, Тихонович, 2011; Sessitsch et al., 2013]. В связи с этим выявление механизмов токсического эффекта кадмия на растительный организм [Gallego et al., 2012] и реализация компонентов его защитных систем, направленных на снижение уровня повреждающего действия ТМ, включая инокуляцию plant growth promoting rhizobacteria (PGPR), обладающими свойством стимуляторов роста растений [Sessitsch et al., 2013; Sessitsch et al., 2013; Munees, Kibret, 2014], относятся к приоритетным задачам. Так, например, обнаружено, что воздействие кадмия и других ТМ индуцируют в растениях окислительный стресс, тогда как инокуляция бактериями способствует запуску в растениях комплекса защитных реакций, направленных на усиление их антиоксидантной защиты, и, следовательно, повышению стресс-устойчивости растений. Негативный эффект кадмия проявляется в торможении потребления растениями элементов минерального питания, тогда как инокуляция бактериями способствует улучшению их потребления, что в конечном счете проявляется в увеличении продуктивности [Белимов, Тихонович, 2011]. Важно отметить, что бактерии рода Bacillus , как и многие другие представители PGPR, отличаются устойчивостью к ТМ, механизмы которой, в частности, основаны на изменении валентности ионов металла для перевода в менее токсичные формы (Pandey et al., 2012), а их способность активно сорбировать Cd на своей клеточной стенке способствует существенному снижению уровня повреждающего действия этого токсического иона на культурные растения [Sheng et al., 2008; Sessitsch et al., 2013].
Одним из важных методических проблем, с которым сталкиваются исследователи, является прямая визуализация эндофитности штаммов в тканях растения. В последнее время в качестве эффективного визуального маркера стали применять чужеродные флуоресцирующие белки. Так, с использованием рекомбинанта эндофитной бактерии Pseudomonas ssp. со встроенным геном флуоресцирующего белка GFP, была произведена попытка изучить процессы интеграции этой бактерии в растения тополя [Germanie et al., 2004]. Оказалось, что интеграция белка GFP негативно отражается на механизмах эндофитной колонизации бактерий и их развитию в тканях тополя. Так, gfp-бактерии хотя и колонизировали корневую систему растений тополя, не могли эффективно заселять ксилемные везикулы корня [Germanie et al., 2004]. Соответственно, исходя из этих данных, можно уверенно говорить о потере такими рекомбинантными бактериями свойств эндофитности. Более того, выявлено, что рекомбинантные gfp-бактерии начинают отрицательно влиять на ростовые характеристики хозяина и активность некоторых защитных белков, вызывая в растениях определенный «стресс-эффект» [Weyens et al., 2012].
Вместе с тем обнаружено, что рекомбинантные бактерии Leifsonia (Clavibacter) xyli с внедренным геном cry1Ac были использованы для биоконтроля кукурузной огневки [Tomasino et al., 1995], в эндофитный изолят B. cereus был введен ген cry2Aa [Mahaffee, Moar, Kloepper, 1994], а в B. megaterium - cry1A [Bora et al., 1994]. Так же cry генами были трансформированы такие колонизирующие растения бактерии как Azospirillum spp., R. leguminosarum, P. cepacia и P. fluorescens [Obukowicz et al., 1986; Skot et al., 1990; Stock et al., 1990; Udayasurian et al., 1995]. Ген cry1Ac7 штамма Bacillus thuringiensis 234 был использован для трансформации эндофитной бактерии Herbaspirillum seropedica, заселяющей ткани сахарного тростника [Downing et al. 2000]. Полученные литературные данные подтверждают возможность успешного получения рекомбинантного штамма на основе эндофитного штамма B. subtilis 26Д.
2.4. Поскольку биопрепарат будет включать консорциум штаммов с защитным действием против ряда патогенов и насекомых-вредителей, использование аналогов которых в отдельности уже разрешено службой Государственной регистрации пестицидов и агрохимикатов, организация проведения регистрационных испытаний, экспертизы регламентов его применения, проведения экспертизы результатов регистрационных испытаний, государственной регистрации, ведение государственного каталога предполагается проводить по упрощенной схеме согласно Распоряжению Минсельхоза России от 12 апреля 2013 г. № 26-р. На первом этапе будет осуществлен скрининг штаммов бактерий рода Bacillus видов subtilis и turinginensis, способных проникать в ткани растений, формировать ассоциации с ними и индуцировать в них иммунную реакцию, а также сохранять способность подавлять рост и развитие патогенов и вредителей. На этом этапе необходим скрининг вирулентных штаммов, поскольку в отсутствие таковой эффективность препарата резко теряется. Следующий шаг - составление эффективных комбинаций эндофитов в биопрепарате. Оценка их эффективности будет проведена на растениях пшеницы и картофеля на основе проявления у препаратов рост-регулирующей, фунгицидной и инсектицидной активностей. Необходимость проведения этого этапа работы диктуется тем, что ранее нами было выявлено, что в ряде случаев биологическая эффективность препарата может быть потеряна из-за изменения концентрационных соотношений составляющих биопрепарат компонентов. На следующем этапе исследований эффективные комбинации препарата будут испытаны в полевых условиях на комплексе патогенов и вредителей пшеницы и картофеля. Создание рекомбинантного варианта эндофита, сочетающего в себе антифунгальную и инсектицидную активности позволит «обойти» описанные выше риски.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
3.1. Полученный биопестицид с антистрессовой активностью, а также технология его применения будут востребованы в сфере промышленного сельскохозяйственного производства продуктов питания, в частности в производстве товарного зерна и картофеля. Предложенный проект соответствует приоритетному направлению развития науки и техники (пункт 4. Технологии живых систем. 4.10. Биологические средства питания и защиты растений и животных). Методы трансформации эндофитных бактерий векторами, несущими гены, контролирующие хозяйственно полезные свойства микроорганизмов, будут использованы в дальнейших молекулярно-биологических разработках в области микробных технологий и синтеза целевых продуктов. Новые штаммы эндофитных бактерий планируется использовать для создания полифункциональных биопрепаратов – биоинсектофунгицидов, с целью использования их в защите сельскохозяйственных культур от вредителей и болезней. Выявление эффекторных свойств микроорганизмов с комбинированной активностью имеет приоритет в расшифровке механизмов их защитного и ростстимулирующего действия на растения и позволит разрабатывать инновационные продукты для растениеводства. Применение новых экологически малоопасных биологических средств защиты растений снизит социальную напряженность в области охраны окружающей среды и здоровья человека.
3.2. Результатом практического внедрения будет биопрепарат с комбинированной инсекто-фунгицидной активностью, позволяющий при одной обработке защищать растения картофеля от вредителей (колорадского жука) и комплекса грибных болезней (фитофтороз, альтернариоз, макроспориоз). В перспективе подобный препарат с комбинированной активностью будет разработан и для применения на посевах зерновых культур для их защиты от злаковых тлей и листовых пятнистостей.
3.3. Решение задач ПНИ окажет существенное влияние на разработку микробиологических средств защиты растений с полифункциональной активностью, сочетающую такие свойства препарата, как стимуляция роста растений, инсектицидность, подавление развития фитопатогенной микрофлоры, сохранность продукции после уборки. На основе выявления уникальных штаммов эндофитных бактерий в спектр активности препаратов могут быть включены пробиотические свойства, а также деструкция микотоксинов. Разработка и внедрение подобных препаратов в сельское хозяйство будет способствовать реализации (в случае принятия) Федерального закона «О производстве органической сельскохозяйственной продукции…». Соответственно при этом увеличится сектор рынка, производящего экологически безопасную продукцию, снизится себестоимость продукции за счет сокращения кратности обработок и сочетания в одном биопрепарате нескольких хозяйственно полезных свойств, что важно для поддержания стабильности в социальной сфере.
Развитие данного направления позволяет расширить рамки международного сотрудничества, особенно актуального для стран Евросоюза, в области разработки технологий производства органической продукции и новых средств их обеспечения. Расширение линейки и объема производства органических продуктов на рынке будет сопровождаться рекламой их безопасности, что одновременно будет способствовать продвижению новых биопрепаратов. При этом через сбыт органической продукции земледелия расширяется информационная инфраструктура популяризации науки и просвещения потребителя.
Разработанный регламент применения такого биопестицида позволит не только снизить инфекционный фон в полевых условиях, но будет способствовать контролю за развитием патогенной микрофлоры в условиях хранения (картофель) без снижения технологических и биологических свойств продукции. Регистрация препарата и его производство планируется на базе ООО НВП «БАШИНКОМ» в соответствии с законом РФ №217-ФЗ. На внутреннем рынке коммерческие предложения на основе такого типа препаратов по защите растений отсутствуют. В связи с этим регламент целевого применения этого препарата следует считать уникальным, не имеющим аналогов. Наиболее функционально близкий к планируемому биопестициду биопрепарат, обладающий фунгицидной активностью и производимый в НВП «БАШИНКОМ» - Фитоспорин М, в настоящее время эффективно применяется в Оренбургской, Курганской, Тамбовской, Краснодарской и других областях на площади не менее 2 млн. га. Результаты предлагаемого проекта могут быть использованы в крупных с-х предприятиях, направленных на производство, как товарной растительной продукции, так и семян.

Текущие результаты проекта:
4.1. Проведен обзор научно-технической литературы по тематике ПНИР, в том числе по направлениям: - современные тенденции в разработке микробиологических препаратов для растениеводства; - состояние и перспективы разработки микробиологических препаратов для защиты растений в России; - ассортимент отечественных биоинсектицидов и биофунгицидов; - маркетинг и перспективы отечественного рынка многофункциональных биопестицидов; - биохимические факторы, способствующие защите растений под влиянием эндофитных бактерий; - способы трансформации бактерий рода Bacillus для создания препаратов с новыми свойствами; - новые штаммы бактерий рода Bacillus с комбинированной биологической активностью; - векторы для трансформации бактерий рода Bacillus. На основании предварительного анализа литературных данных о физиологическом эффекте штаммов ризосферных бактерий, обладающих высокой защитной активностью, потенциальных источников будущих биопрепаратов, подготовлена обзорная работа "The role of Bacillus bacterium in formation of plant defense: Mechamism and reaction" для последующей публикации в 2014 г. в 1-м целевом сборнике трудов "Microbial bioresurses" зарубежного издательства CABI (Wallingford, UK). На основе проанализированных данных выбран подход, наиболее оптимальный для последующей работы с генами инсектотоксичных белков бактерии B.thuringiensis и подобраны праймеры для клонирования одного из генов.
4.2. На основании выполненного обзора научно-технической литературы по тематике проведен выбор направления исследований. В качестве разрабатываемого направления ПНИР определено создание многофункциональных биопрепаратов с комплексной активностью на основе эндофитных микроорганизмов.
4.3. Проведены патентные исследования по поиску препаратов на основе эндофитных бактерий с инсектофунгицидной активностью. Проведены разработки по обнаружению прототипов для создания экспериментального образца. Определены основные виды бактерий в качестве безопасных, эффективных и коммерчески выгодных основ биопрепаратов. Таковыми признаны виды Bacillus subtilis и Bacillus thuringiensis.
4.4. Определены основные возбудители болезней и насекомые - вредители, являющиеся наиболее вредоносными для главных продовольственных культур региона и России – яровой пшеницы и картофеля. На основе этого разработан план проведения экспериментальных исследований по оценке биологической эффективности применения эндофитных, а также энтомопатогенных штаммов бактерий в защите указанных сельскохозяйственных культур от болезней и вредителей.
4.5. Проведены экспериментальные работы по подбору эффективных комбинаций штаммов бактерий Bacillus ssp. c фунгицидной и инсектицидной активностями для получения многофункционального препарата. С этой целью заложены полевые опыты на посевах яровой пшеницы и картофеля по оценке эффективности обработки растений биопрепаратами в защите от колорадского жука и фитофтороза картофеля, септориоза и фузариоза колоса яровой пшеницы. Установлено, что в качестве основного компонента многофункционального биопрепарата предпочтительно использовать эндофитные штаммы бактерий вида B. subtilis. Выявлено, что одним из них может служить эндофитный штамм B. subtilis 26Д. В настоящее время ведется оценка влияния образцов биопрепаратов на урожайность культур и качество продукции.
Выявлено большое распространение на растениях картофеля листовых пятнистостей, увеличивающееся в течение вегетационного сезона. Из пораженных тканей контрольных растений выделены возбудители альтернариоза (Alternaria solani), фитофтороза (Phytophthora infestans) и корневых гнилей (преимущественно из рода Fusarium ssp.). Обнаружено снижение на не менее 30% распространенности поражения вегетирующих растений в полевых условий, отмеченными патогенами, на опытных делянках, в особенности при отдельном применении препарата Фитоспорин. На растениях обработанных препаратом Битоксибацилин эффекта снижения степени поражения растений не обнаружено. Важно заметить, что при обработке растений композицией из этих двух препаратов защитный эффект сохранялся на уровне препарата Фитоспорин.
Проведен анализ заселенности растений картофеля колорадским жуком. Выявлено, что если в контрольных растениях этот показатель составлял 60%, то при обработке препаратом Битоксибацилин он снижался до 9%, а препаратом Фитоспорин - до 38%. В смеси коэффициент заселенности в тех же условиях снижался до 4%. Таким образом использование композиций бактерий из отмеченных препаратов представляет большую перспективу в борьбе с этим вредоносным насекомым на посадках картофеля, чем в отдельности.
Анализ клубней на наличие патогенов показал, что в клубнях из контрольных делянок наибольшую распространенность имели парша обыкновенная, сухая гниль клубней, фитофтороз и повреждения проволочником. Битоксибациллин был не эффективен против этих болезней и проволочника. В то же время обработка Фитоспорином в отдельности и в смеси Битоксибациллином сокращала количество поврежденных болезнями клубней более чем на 30%, однако повышало их поражение проволочником. В итоге обработка препаратом Фитоспорин и его смесью с препаратом Битоксибациллин повышала в среднем на 20%. Таким образом, наиболее эффективными против поражения растений заболеваниями была комбинация Фитоспорина с Битоксибациллином.
4.6. Проводится оптимизация условий культивирования микроорганизмов с целью разработки лабораторного регламента получения многофункционального биопрепарата. Проведен поиск технологий получения сухих форм бактерийных препаратов, в том числе на основе разработок индустриального партнера.
4.7. Проведена оценка фунгицидной (против септориоза пшеницы и фитофтороза картофеля) и инсектицидной (против колорадского жука) активностей штаммов бактерий B. subtilis и B. thuringiensis. С использованием стерильных растений картофеля была показана способность штаммов бактерии B. subtilis 26Д эндофитно существовать в его тканях. Штамм выделялся практически из всех органов растения. Выявлено, что инокуляция бактерией заметно снижает степень поражения фитофторозом и коэффициент поедания колорадским жуком. Кроме того выявлено, что штамм бактерии B. subtilis 26Д защищал растения картофеля посредством активации экспрессии генов, кодирующих анионную пероксидазу М21334 и ингибиторы протеиназ SGN-U313509, проявления антагонистической активности in vitro против возбудителя фитофтороза Phytophthora infestans. Изучена антагонистическая активность бактерий по отношению к микрофлоре кишечника жесткокрылых на примере колорадского жука, чем может объясняться увеличение смертности колорадского жука после поедания инокулированных данным штаммом растений. Поскольку основной ущерб посевам картофеля наносят именно личинки колорадского жука, подобное свойство штамма B. subtilis позволяет считать, что этот биопрепарат может быть эффективным не только для защиты от патогенов, но будет предотвращать уничтожение и от вредителей. Полученные результаты подготовлены для публикации в российском журнале «Прикладная биохимия и микробиология». Кроме того, результаты полученных экспериментов доложены на Всероссийской конференции с международным участием, посвященной памяти профессора Киреевой Н.А. «Биотехнология – от науки к практике». Уфа, 23-26 сентября 2014 г.). В опубликованных материалах конференции указано, что работа поддержана грантом Министерства образования и науки Российской Федерации. На основе полученных результатов, с учетом перспективы коммерциализации разработки отобраны штаммы бактерий B. subtilis и B. thuringiensis для создания многофункционального препарата для защиты растений от вредителей и болезней. Проведены исследования по подбору оптимальных условий культивирования штаммов микроорганизмов для наработки экспериментальных образцов биопрепарата. Определен состав сред, параметры температуры, аэрации, скорости перемешивания. В результате проведенных НИР получены прототипы экспериментальных образцов многофункционального биопрепарата для защиты картофеля и пшеницы.
4.8. Разрабатывается методика тестирования эффективности препарата против возбудителей болезней и вредителей пшеницы картофеля и подбор биохимических маркеров для более эффективной оценки. Проведен поиск наиболее устойчивых и восприимчивых к патогенам сортов пшеницы, а также поиск маркерных генов для последующего анализа их ответной реакции на инфицирование. Показано, что наиболее восприимчивым к септориозу является сорт пшеницы Казахстанская 10, а наиболее устойчивым - Омская 35. Выявлено, что ферменты оксидоредуктазного ряда характеризуются наибольшей чувствительностью к инфицированию патогенами. Под воздействием составляющих препарата происходит усиление экспрессии генов защитных белков пшеницы, таких как пероксидаза, оксалатоксидаза, хитиназа и изменение в профиле протеома инфицированных растений. На основании предварительных данных опубликована статья в журнале "Agricultural science", с указанием, что работа выполнена при финансировании со стороны Министерства образования и науки РФ.
Изучались биохимические изменения в растительных клетках под влиянием патогенов и бактериального штамма B. subtilis 26Д. Показано положительное влияние бактериального штамма B. subtilis 26Д на генерацию пероксида водорода, транскрипционную активность генов, кодирующих защитные белки PR-2, PR-3, PR-9, и содержание цитокининов в инфицированных растениях пшеницы, приводящее к уменьшению симптомов болезни и повышению устойчивости растений-хозяев. Показано положительное влияние композиций бактериального штамма B. subtilis 26Д с салициловой кислотой и дифференцированное воздействие композиций с жасмоновой кислотой имеющее концентрационную зависимость, на защитные реакции растений пшеницы к патогенному грибу S. nodorum. Полученные результаты можно использовать в качестве эффективных маркеров, для оценки прохождения процесса защитного ответа растений на инфицирование и использование композиции бактериального штамма с сигнальными молекулами.
4.9. В целях популяризации исследований участники гранта – сотрудники ИБГ УНЦ РАН и индустриального партнера ООО НВП «БашИнком» дали совместное интервью корреспонденту телекомпании «Башкирское спутниковое телевидение». Телевизионная передача под рубрикой «Наука 102» с участием указанного выше коллектива о полезных свойствах эндофитных микроорганизмов и перспективы коммерциализации разработок на их основе была показана в эфире этого канала 18 сентября 2014 г. Кроме того, в целях популяризации знаний участники соглашения выступали с пленарными и секционными докладами, с включением в них части результатов ПНИ, на международных и всероссийских конференциях. В частности во Всероссийской конференции с международным участием, посвященной памяти профессора Киреевой Н.А. «Биотехнология – от науки к практике» (Уфа. 23-26 сентября 2014 г.), Международной научной конференции «Генетические ресурсы растений - основа продовольственной безопасности и повышения качества жизни (С.-Петербург. 6-8 октября 2014 г.), VII Всероссийский с международным участием конгрессе молодых ученых-биологов Симбиоз-Россия (Екатеринбург. 6-9 октября 2014).
4.10.Индустриальный партнер ООО НВП «БашИнком» способствует эффективному проведению исследований путем материального и технического обеспечения наиболее трудоемких работ.