Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка биотехнологических средств комплексного контроля пищевых продуктов и кормов на контаминацию микотоксинами

Докладчик: Дзантиев Борис Борисович

Должность: Зам. директора, д.х.н., проф.

Цель проекта:
Проект направлен на разработку и испытание новых биоаналитических систем для контроля токсичных веществ в сельскохозяйственной продукции и продуктах питания. В ходе выполнения проекта будут разработаны и изготовлены экспериментальные образцы иммунохимических тест-систем определения приоритетных микотоксинов – афлатоксина В1, дезоксиниваленола (вомитоксина), зеараленона, фумонизина, Т-2 токсина, охратоксина А в пшенице, ячмене, кукурузе, а также в продуктах их переработки. Преимущества разрабатываемых тест-систем. 1. Сокращение продолжительности анализа с нескольких часов до 1 часа (в случае высокочувствительного иммуноферментного определения) или до 10-15 минут (в случае экспрессного иммуноферментного или иммунохроматографического анализа). 2. Достижение чувствительности до 0,15 нг/г пробы. 3. Высокая производительность тестирования. 4. Низкая стоимость тест-систем. Разрабатываемые решения позволят проводить комплексную оценку контаминации сырья и продуктов питания, тем самым снизив риски негативного воздействия на население и сократив экономические издержки, связанные с реализацией традиционных аналитических решений. Создаваемые тест-системы, сочетающие высокие аналитические характеристики, новые методические решения и высокую производительность, будут обладать серьёзными конкурентными преимуществами по сравнению с существующими аналитическими подходами и решениями в области контроля качества и безопасности продуктов питания.

Основные планируемые результаты проекта:
Выполняемый проект обеспечит получение следующих результатов:
• будут предложены эффективные алгоритмы прогнозирования характеристик иммунохимических методов анализа и экспериментально подтверждена их пригодность для выбора тест-систем в соответствии с практическими требованиями;
• будут установлены требования к составу компонентов иммунохимических тест-систем, обеспечивающие достижение оптимальных аналитических характеристик (предел обнаружения и полнота выявления целевого соединения);
• будут определены и обоснованы наиболее эффективные методики получения реагентов и контроля их функциональных параметров;
• эффективность разработанных подходов будет подтверждена реализацией экспериментальных образцов иммунохимических тест-систем для определения микотоксинов с пределами обнаружения 0,15–10 нг/мл (в зависимости от соединения), длительностью 15-60 мин (в зависимости от метода определения) и степенью выявления целевых соединений в пробах сельскохозяйственной продукции и продуктах питания не менее 97%;
• будут подготовлены проекты инструкций по применению разработанных тест-систем для определения целевых антигенов;
• будет подготовлен проект методических рекомендаций по применению разработанных тест-систем для анализа микотоксинов в пище и продукции сельского хозяйства;
• будет разработан лабораторный технологический регламент изготовления экспериментальных образцов аналитических систем;
• будет подготовлен проект технического задания на проведение ОКР по теме: «Создание технологии производства биосенсорных тест-систем контроля пищевых продуктов и кормов на контаминацию микотоксинами».

Будут изготовлены и апробированы новые тест-системы трех видов:
1) тест-система для внелабораторного контроля продукции на основе иммунохроматографических тест-полосок, сочетающая простоту пробоподготовки, высокую скорость определения (менее 15 мин) и возможность мультипараметрической детекции;
2) тест-система для высокочувствительного лабораторного контроля токсичных контаминант на основе иммуноферментного анализа с хемилюминесцентной детекцией и концентрированием с помощью магнитных иммуносорбентов (с достижением пределов обнаружения, достаточных для контроля качества продуктов детского питания);
3) экспрессная иммуноферментная система с визуальной детекцией, позволяющая при внелабораторном тестировании обеспечить высокочувствительный анализ (продолжительность анализа, включая пробоподготовку, – менее 25 мин).

Пределы обнаружения для систем (1), (3) составят: 5 нг/г – для афлатоксина В1; 700 нг/г – для дезоксиниваленола; 200 нг/мл – для фумонизина; 200 нг/г – для зеараленона; 100 нг/г – для Т-2 токсина; 5 нг/г – для охратоксина А.
Пределы обнаружения для системы (2) составят: 0,15 нг/г – для афлатоксина В1; 50 нг/г – для дезоксиниваленола; 200 нг/мл – для фумонизина; 5 нг/г – для зеараленона; 50 нг/г – для Т-2 токсина; 0,5 нг/г – для охратоксина А.

Имеющиеся на российском рынке аналитические системы для определения микотоксинов разработаны для определения контаминированности кормов, но не пищевых продуктов, где требования к пределам обнаружения на порядки ниже. Импортная продукция в большинстве случаев также не отвечает требованиям чувствительности и/или экспрессности. В литературе по данному направлению, в основном, представлена демонстрация принципиальной возможности проведения анализа без конкретизации технологических особенностей производства иммуноаналитических систем. Мультианализ в коммерческих изделиях, как правило, ограничивается определением двух соединений.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Высокая востребованность тест-систем для контроля микотоксинов определяется их ключевой ролью для оценки качества сельскохозяйственных культур. По оценкам, более 25% продукции сельского хозяйства контаминировано микотоксинами (Тутельян, 2012). Только для афлатоксина и только прямые потери составляют полмиллиарда долларов в год (Van Egmont et al., 2014). В зависимости от содержания микотоксинов определяется сортность пшеницы, что может оказать радикальное влияние на экспортный потенциал отечественной продукции. Исходя из этого, своевременный и тщательный контроль микотоксинов как в готовой продукции, так и на всех стадиях ее производства является неотъемлемой и важной частью повышения экономического благосостояния страны.

Выполняемый проект непосредственно направлен на создание и характеристику прототипных образцов иммуноаналитических систем, которые рассматриваются как объекты последующих опытно-конструкторских работ. Работы по проекту включают изготовление и апробацию экспериментальных образцов тест-систем, а также подготовку документации для масштабируемых технологий производства тест-систем.
Планируемые разработки характеризуются высокой актуальностью с экономической точки зрения – как средство повышения эффективности сельскохозяйственных производств, и с политической точки зрения – как средство развития импортозамещающего производства.
Исходя из имеющегося у заявителя опыта внедрения в практику других видов иммунодиагностических систем, в рамках проекта будут решаться вопросы, принципиальные для повышения потребительской ценности и конкурентного потенциала изделий, такие как максимальное сокращение продолжительности стадий пробоподготовки, обеспечение стабильности тест-систем при хранении, возможности тестирования широкого круга объектов в рамках контроля сырья и технологических процессов переработки пищевой и кормовой продукции.

Текущие результаты проекта:
Проект направлен на создание трех типов иммуноаналитических систем для комплексного контроля микотоксинов в продукции сельского хозяйства.
Предложено создание новых видов тест-систем, характеризующихся рядом особенностей:
• Для экспрессных тест-систем это сочетание иммунохроматографического анализа и усиления регистрируемого аналитического сигнала в рамках одной тест-полоски и одной стадии анализа, без использования дополнительных жидких реагентов.
• Для высокочувствительной иммуноферментной тест-системы – сочетание быстрого формата магнитного концентрирования аналита из больших объемов проб (с непосредственной последующей детекцией, без стадий десорбции) и высокочувствительной хемилюминесцентной регистрацией ферментного маркера.
• Для экспрессного иммуноферментного анализа – реализация кинетического анализа во внелабораторных условиях с бесприборной регистрацией результатов, соответствующих превышению контролируемых пороговых уровней содержания контаминант.
Проведенный патентный поиск и анализ научной литературы подтверждает новизну и конкурентный потенциал предлагаемых решений.

Работы первого этапа были направлены на получение и характеристику компонентов разрабатываемых иммуноаналитических систем.
Для каждого из 6 целевых антигенов проведен скрининг специфических антител, включавший от 3 до 10 клонов, полученных из разных источников. Проводилась оценка ряда параметров – кинетических и термодинамических констант связывания с использованием безмаркерной биосенсорной системы на основе поверхностного резонанса, предела обнаружения микотоксина и рабочего диапазона количественного определения в микропланшетной иммуноферментной системе. Исходя из полученного массива данных, были отобраны антитела для дальнейшей работы. Пределы обнаружения антигенов с использованием выбранных антител варьировали в диапазоне 20 пг/мл – 2 нг/мл в зависимости от микотоксина и находились в соответствии с нормативными требованиями к контролируемым концентрациям данных соединений.
Проведен скрининг ряда коммерческих и синтезированных в рамках проекта конъюгатов микотоксинов с белком-носителем или ферментной меткой, используемых в конкурентном иммуноанализе. Для каждого из 6 микотоксинов было сопоставлено от 3 до 7 конъюгатов, полученных при варьировании следующих параметров: а) выбор белка-носителя; б) структура конъюгируемого гаптена; в) соотношение белок-гаптен. Полученные конъюгаты испытывались как в иммуноаналитических системах, так и в биосенсорной системе на основе поверхностного плазмонного резонанса, что позволило получить количественные оценки иммуноспецифического взаимодействия. На основании экспериментальных данных были отобраны конъюгаты, обладающие наибольшей потенциальной эффективностью в иммунохроматографическом и иммуноферментном анализе.
Получены наноразмерные носители для иммуноферментного и иммунохроматографического анализа. В первом случае синтезировались магнитные частицы на основе оксида железа диаметром от 5 до 20 нм, во втором – частицы коллоидного золота диаметром от 20 до 50 нм. Препараты, синтезированные по разным протоколам, были охарактеризованы методами просвечивающей электронной микроскопии и динамического светорассеяния. Полученные результаты отражают высокую степень гомогенности наночастиц по размерам и форме. Получены конъюгаты наночастиц с иммунореагентами и проведена их характеристика методами иммуноферментного анализа и атомно-силовой микроскопии. Полученные результаты позволяют рекомендовать для аналитического применения препараты магнитных наночастиц со средним диаметром 10 нм и золотых наночастиц со средним диаметром 25-30 нм, конъюгированных с антителами.

Предусмотренные календарным планом работы выполнены в полном объеме. Полученные результаты обеспечивают предпосылки успешной реализации последующих задач.

На средства индустриального партнера, ООО «Русхимбио», выполнен предусмотренный календарным планом комплекс работ. Проведено маркетинговое исследование рынка средств контроля микотоксинов, показавшее высокую востребованность реализуемых решений как в государственном, так и в частном секторе. Показано доминирование иностранных компаний на российском рынке, особенно среди иммунохимических методов, где конкуренция с отечественной стороны практически отсутствует.
Выбрана производственная площадка для планируемого производства тест-систем, проведен цикл работ по проектированию и монтажу коммуникаций общего назначения. Учитывая требования к режимам температуры и влажности при производстве тест-систем, значимые для обеспечения их стабильности при хранении, в помещениях были смонтированы соответствующие климатические установки.
Проведен подробный скрининг коммерческого технологического оборудования, как для выпуска иммунохроматографических тест-систем, так и для производства иммуноферментных наборов. Проведено сопоставление возможностей российских конструкторских компаний, способных создать автоматизированные решения для производства. Выбраны оптимальные технологические решения и оборудование для нанесения реагентов на мембраны и в микроплашеты, установки для сушки и нарезки листов при производстве иммунохроматографических тест-полосок, производственные линии для разлива жидких реагентов, входящих в комплект иммуноферментных наборов, производственные линии для упаковки и маркировки компонентов иммуноаналитических тест-систем. Частично закуплено производственное оборудование и начаты работы по его запуску.