Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка эпигенетических сигнатур для выявления колоректального рака на ранних стадиях

Докладчик: Дегтярев Сергей Харитонович

Должность: заведующий отделом ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор", профессор, доктор биологических наук

Цель проекта:
Целью проекта является создание инновационной эпигенетической тест-системы для диагностики колоректального рака на ранних стадиях на основе GLAD-ПЦР технологии, получение экспериментальной партии тест-системы, оценка ее чувствительности и специфичности на клиническом материале. В задачи исследования входит: 1. Разработка метода выявления маркеров метилирования ДНК в образцах плазмы крови на основе GLAD-ПЦР анализа. Для исследования будет использоваться наиболее доступный и универсальный материал – образец периферической крови. В ходе реализации проекта будет разработана специальная методика выявления маркеров метилирования в ДНК из плазмы крови. Обнаружение метилированной ДНК впервые будет проводиться посредством GLAD-ПЦР анализа. На технологию GLAD-ПЦР анализа оформлен патент РФ. Технология представляет из себя трехстадийный метод детекции метилированной ДНК «в одной пробирке» и включает в себя: 1) гидролиз образца ДНК метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазой GlaI; 2) присоединение к концам гидролизованной ДНК универсального олигонуклеотидного адаптера; 3) флуоресцентную ПЦР в реальном времени, при которой наработка продукта происходит только с гидролизованной ДНК-матрицы. Этот метод обладает высокой чувствительностью и не требует специального оборудования, за исключением обычного оборудования для проведения ПЦР в реальном времени; время анализа составляет не более 6 часов. 2. Выбор генов-кандидатов и проведение скрининга образцов ДНК из плазмы периферической крови, полученных от различных групп больных и здоровых доноров, на предмет их метилирования. Планируется использовать известные, описанные в литературе маркеры метилирования ДНК при онкозаболеваниях, а также результаты собственных исследований. 3. Формирование сигнатур эпигенетических маркеров для колоректального рака. В результате выполнения проекта будет сформирован набор сигнатур эпигенетических маркеров для GLAD-ПЦР диагностики колоректального рака 4. Создание лабораторного экспериментального образца эпигенетической тест-системы (на основе разработанных сигнатур) для диагностики колоректального рака на ранних стадиях методом GLAD-ПЦР анализа. 5. Исследование количественных параметров лабораторного экспериментального образца тест-системы. Разработанная GLAD-ПЦР тест-система будет охарактеризована с точки зрения чувствительности и специфичности.

Основные планируемые результаты проекта:
В рамках проекта планируется получить следующие результаты:
1. Технико-экономическое обоснование разработки усовершенствованных препаратов ферментов.
2. Технические требования и предложения по разработке, производству и применению ферментных препаратов проекта (с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера).
3. Лабораторный регламент получения MD-эндонуклеазы GlaI, пригодной для GLAD-ПЦР анализа.
4. Лабораторный регламент определения чистоты ДНК эндонуклеаз.
5. Протокол клинических исследований.
6. Лабораторный регламент забора и предварительной обработки биологических образцов.
7. Лабораторный регламент выделения ДНК из биологических образцов пригодной для GLAD-ПЦР анализа.
8. Список эпигенетических онкомаркеров колоректального рака.
9. Сигнатура для диагностики колоректального рака на базе эпигенетических онкомаркеров.
10. Специфические олигонуклеотидные праймеры и TaqMan-зонды к маркерным участкам ДНК.
11. Эскизная конструкторская документация на лабораторный экспериментальный образец эпигенетической тест-системы (на основе разработанных сигнатур) для диагностики колоректального рака на ранних стадиях методом GLAD-ПЦР анализа.
12. Проект инструкции по применению тест-системы.
13. Лабораторный экспериментальный образец эпигенетической тест-системы (на основе разработанных сигнатур) для диагностики колоректального рака на ранних стадиях методом GLAD-ПЦР анализа.
14. Экспериментальные данные эпигенетической диагностики не менее 200 пациентов с колоректальным раком и не менее 200 здоровых доноров.
15. Технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации набора эпигенетической тест-системы (на основе разработанных сигнатур) для диагностики колоректального рака на ранних стадиях методом GLAD-ПЦР анализа с учетом технологических возможностей индустриального партнера.
16. Проект технического задания на проведение ОКР по теме: «Разработка технологий производства и выпуск опытных партий эпигенетической тест-системы для диагностики колоректального рака на ранних стадиях методом GLAD-ПЦР анализа».

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Успешное внедрение полученных в работе результатов обеспечит создание инновационных тест-системы эпигенетической ДНК-диагностики, ориентированной на программы массового скрининга здоровья населения с целью выявления онкологических заболеваний на ранних стадиях, что способствует укреплению здоровья и повышению качества жизни граждан и в целом соответствует целям приоритетного национального проекта «Здоровье».
Нужно отметить, что результаты предлагаемого исследования направлены в первую очередь на получение принципиально новой продукции, аналогов которой нет ни в России, ни в мире. Однако результаты могут быть использованы также для улучшения технико-экономических характеристик существующих методов эпигенетической диагностики. Наряду с этим, результаты работы по проекту (в частности, методика выявления маркеров метилирования ДНК) могут быть использованы подразделениями научно-исследовательских институтов, занимающимися вопросами эпигенетики заболеваний.
Потенциальными потребителями конечных тест-систем выступают специализированые онкоцентры, а также диагностические лаборатории и диагностические центры общего профиля, как государственные, так и частные.
Коммерциализация результатов проеккта позволит российским компаниям-производителям занять прочные позиции в этой нише и в России, и в мире.

Текущие результаты проекта:
1) Формируется аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ.
2) Проведены патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96.
3) Сформирован предварительный перечень из 20 перспективных эпигенетических онкомаркеров колоректального рака (гены-онкосупрессоры RARB, SEPT9b, RASSF1a, CCNA1, CEBPD, EGFR, HS3ST2 и др.) для анализа в образцах клинического материала и формирования сигнатур.
4) Проведена оценка качества метилзависимой ДНК-эндонуклеазы GlaI, эндонуклеазы рестрикции TaqI, высокоактивной Т4-ДНК-лигазы, Hot-Start ДНК-полимеразы, предназначенных для разработки тест-системы. Сформулированы требования к поставщику ферментов.
5) Разработана методика определения чистоты ДНК-эндонуклеаз.
6) Начато формирование коллекции образцов биологического материала, полученного из плазмы периферической крови.
7) На 10 пробах биологического материала опробованы 5 способов выделения ДНК, а именно: фенольная депротеинизация, выделение ДНК на спин-колонках «БиоСилика», «Qiagen», «Zymo Research», на колонках для выделения ДНК производства «СибЭнзайм».
8) Разработана методика забора и предварительной обработки биологических образцов.
9) Выявлено критическое влияние факторов времени от момента забора крови до получения плазмы и способа взятия биологического материала на определение метилирования ДНК. Произведен подбор оптимального способа предобработки клинических образцов для повышения выхода выделенной ДНК.

За счет внебюджетных средств (исполнитель - ООО «СибЭнзайм»):
10) Формируются технические требования и предложения по разработке производству и применению высокоочищенных и высококонцентрированных препаратов ферментов для создания тест-системы, в том числе, выполнены следующие работы:
- подбор условий (температуры, времени выращивания, оптической плотности культуральной жидкости, состава питательной среды) выращивания штаммов-продуцентов ферментов (Taq-ДНК-полимеразы, лигазы, метилзависимой ДНК-эндонуклеазы GlaI), которые предназначены для разрабатываемой тест-системы (с целью получения максимального выхода целевого продукта с единицы объёма культуральной жидкости);
- подбор условий масштабирования процесса наработки биомассы штаммов-продуцентов ферментов в связи с планируемым увеличением объема выпуска, связанного с обеспечением разработок и последующего производства разрабатываемой тест-системы;
- разработка генно-инженерной конструкции путём встраивания гена Taq-ДНК-полимеразы в экспрессирующий вектор pBADThio с целью получения штамма-продуцента, секретирующего целевой фермент в периплазму для облегчения последующей хроматографической очистки в условиях производства и уменьшения производственных расходов;
- подбор новых схем хроматографической очистки Taq-ДНК-полимеразы из штамма-суперпродуцента;
- доработка схем проведения контроля качества Taq-ДНК-полимеразы, лигазы, метилзависимой ДНК-эндонуклеазы GlaI, в связи с изменениями, вызванными масштабированием процессов наработки;
- разработка и внесение изменений в организационную и технологическую структуру предприятия в связи с планируемым увеличением объема выпуска высокоочищенных и высококонцентрированных препаратов ферментов Taq-ДНК-полимеразы, лигазы, метилзависимой ДНК-эндонуклеазы GlaI.