Регистрация / Вход
Прислать материал

Получение препаратов рекомбинантных гидролитических ферментов для кормоподготовки и ветеринарии

Докладчик: Леонтьевский Алексей Аркадьевич

Должность: Зам. директора ФГБУН Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, доктор биологических наук

Цель проекта:
Задачей, которая решается в ходе выполнения проекта - обеспечение сельского хозяйства новыми антибактериальными препаратами, не относящимся к антибиотикам, и повышение продуктивности животноводства за счёт улучшения питательных свойств кормов. Цель реализуемого проекта: Вывод на рынок новых высокоэффективных ферментных препаратов на основе рекомбинантных бактериолитических гидролаз для лечения и профилактики бактериальных заболеваний животных, а так же препаратов на основе рекомбинантных осахаривающих гидролаз для улучшения питательных свойств кормов животных.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Поиск, клонирование и анализ генов гидролаз различных штаммов бактерий, депонированных во Всероссийской коллекции микроорганизмов.
Поиск генов гидролаз будет проводиться среди бактерий с опубликованным в GeneBank полным геном для тех видов, штаммы которых депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов. Среди опубликованных геномов будет проведен поиск генов гидролаз на основании консервативных доменов характерных для различных групп гидролаз. Обнаружение консервативных доменов необходимо для предсказания возможной активности гилролаз, поскольку наличие определенных доменов в последовательности белка может свидетельствовать о принадлежности гидролазы к определенной группе с характерной активностью. На основании анализа будут отобраны гены сахаролитических гидролаз: целлюлаз, гемицеллюлаз, амилаз, бета-глюканаз, бета-глюкозидаз, а так же гены литических протеаз и мурамидаз. На основании отобранных последовательностей генов будут разработаны праймеры для метода ПЦР, с помощью которого будет проводиться наработка генов гидролаз. Гены, полученные с помощью ПЦР, будут секвенированы. Будет секвенирован и аннотирован геном бактерии Lysobacter sp.
2. Получение рекомбинантных продуцентов, наработка рекомбинантных гидролаз, изучение свойств рекомбинантных гидролаз.
На основе клонированных генов гидролаз будут получены рекомбинантные продуценты. Будет проведена работа по разработки оптимальной системы экспрессии рекомбинантных гидролаз. Оптимизация системы экспрессии необходима для подбора системы экспрессии, обеспечивающей максимальный выход гидролаз с наименьшими затратами (затраты на среду культивирования, время культивирования, затраты на стоимость индуктора и т.п.), что важно для получения ферментных препаратов. Отдельная работа по получению рекомбинантных продуцентов литических гидролаз. Рекомбинантные литические гидролазы при значительной продукции могут лизировать клетки рекомбинантного продуцента. Будут опробованы два способа решения этой проблемы: наработка литических гидролаз в неактивном состоянии в виде телец включения с последующей их реактивацией в процессе выделения; использование рекомбинантных продуцентов на основе хозяина, который не гидролизуется литическими гидролазами, например грибных продуцентов. Для получения рекомбинантных продуцентов будут использованы коммерческие системы экспрессии на оcнове продуцентов бактерий и грибов родов Bacillus, Pseudomonas, Pichia, Saccharomyces. Рекомбинантные гидролазы будут получены в электрофоретически гомогенном состоянии. После получения препаратов рекомбинантных гидролаз будет проведено исследование их свойств. Препараты осахаривающих гидролаз будут охарактеризованы по субстратной специфичности в отношении различных полисахаридов. Субстратная специфичность литических ферментов будет охарактеризована по их способности гидролизовать клеточные стенки (пептидогликаны) грамположительных и грамотрицательных бактерий. Будет исследована литическая активность рекомбинантных литических гидролаз в отношении патогенных и антибиотикоустойчивых форм бактерий родов Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia, Pseudomonas, Bacillus.
3. Разработка ферментных препаратов и их испытание.
По результатам изучения свойств рекомбинантных ферментов будут отобраны сахаролитические гидролазы, обладающие наибольшей термостабильностью, высокой удельной активностью в отношении полисахаридов, необходимым оптимумом рН. Будут отобраны литические гидролазы с наибольшей термостабильностью и наибольшей литической способностью в отношении патогенных бактерий. На основе рекомбинантных гидролаз будут разработаны ферментные препараты гидролаз и проведена проверка их свойств. Ферментные препараты для улучшения питательных свойств кормов на основе осахаривающих гидролаз будут получены с помощью смешивания рекомбинантных гидролаз. Оптимальное сочетание гидролаз будет найдено экспериментально. Будет проведена работа по определению условий хранения ферментных препаратов и стабилизации их активности при хранении. Для стабилизации в ферментные препараты будут вносить стабилизаторы в различных концентрациях (соли, сахара, детергенты). Будет разработана используемая форма препаратов (жидкая, лиофилизованная, гранулированная). Будет проведена отработка условий масштабного получения ферментных препаратов – в ферментёрах. После разработки ферментных препаратов и наработки опытных образцов препаратов будет проведены исследовательские испытания их свойств. Будут испытаны свойства осахаривающих препаратов гидролаз по улучшению питательных свойств сырья для кормов животных. Будут испытаны литические свойства препаратов в отношении патогенных бактерий и изучен лечебный потенциал на модельных инфекциях, вызванных в т.ч. устойчивыми к антибиотикам штаммами Staphylococcus aureus (MRSA), Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, смоделированных у белых мышей. По результатам проделанной работы будут разработаны технологические лабораторные регламенты получения ферментных препаратов и рекомендации по применению ферментных препаратов.
4. Изучение трехмерной структуры рекомбинантных гидролаз.
Для расшифровки трехмерной структуры рекомбинантных гидролаз в первую очередь необходимо получить пригодные для рентгеноструктурного анализа кристаллы лакказ. Будет проведен поиск условий кристаллизации рекомбинантных гидролаз в свободном состоянии, полученные кристаллы будут протестированы на генераторе рентгеновского излучения. С пригодных для рентгеноструктурного анализа кристаллов будут собраны наборы дифракционных данных с использованием источника синхротронного излучения и определены пространственные структуры. Для кристаллизации будут использоваться рекомбинантные гидролазы как обладающие высокой термостабильностью или высокой литической способностью, так гидролазы с лучшими свойствами. После расшифровки структуры будет проведено сравнение полученных структур гидролаз как друг с другом, так и со структурами гидролаз, депонированными в базе PDB, для которых были описаны физико-химические свойства (будут исследованы литературные данные). Будут выявлены аминокислотные остатки аминокислот активных центров литических гидролаз, ответственных за литическую активность ферментов. Путём сравнения структур термостабильных и нетермостабильных рекомбинантных гидролаз будут идентифицированы аминокислотные остатки, стабилизирующие молекулу гидролазы.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Разрабатываемые ферментные препараты для улучшения свойств кормов животных и ветеринарии могут применяться в животноводстве. Применение ферментных препаратов для осахаривания кормов снижает затраты на корма животных, что снизит себестоимость продукции. Спрос на ферментные препараты обеспечивается растущим рынком их сбыта, как в России, так и в мире. Препараты гидролаз для лечения и профилактики бактериальных заболеваний способны замещать антибиотики при лечении животных. Препараты способны к патентованию за счет использования гидролаз, ранее в патентах не заявленных, получения уникальных композиций гидролаз, активных в отношении различных групп бактерий, использования гидролаз уникального штамма Lisobacter sp. Препараты для ветеринарии способны лечить бактериальные заболевания животных, что обеспечивает увеличение производства животной продукции и её качества. Спрос на препарат может обеспечивается способностью их замещать антибиотики, отсутствием на рынке аналогов со сравнимой эффективностью.
Конечными потребителями препаратов гидролаз могут быть как крупные животноводческие хозяйства, так и частные животноводческие подворья.

Текущие результаты проекта:
Отобраны штаммы, депонированные во Всероссийской коллекции микроорганизмов, в геноме которых содержатся гены осахаривающих и бактериолитических гидролаз.Среди геномов отобранных бактерий проведён поиск генов, кодирующих осахаривающие гидролазы и бактериолитические гидролазы. Обнаружено более 200 генов, кодирующих гидролазы. Отобранные штаммы были культивированы, получена биомасса бактерий, из биомассы выделена тотальная ДНК. Проводятся работы по клонированию генов. Секвенирован геном бактерии Lysobacter sp. В геноме идентифицированы 5 генов, кодирующих уникальные бактериолитические гидролазы. Проведён патентный поиск по тематике проекта.