Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка аналитической тест-системы на основе анализа уровня микроРНК в плазме крови для малоинвазивной диагностики рака предстательной железы

Докладчик: Саматов Тимур Рустэмович

Должность: старший научный сотрудник, Директор по науке

Цель проекта:
1.1 Создать аналитическую тест-систему на основе динамических биомаркеров для диагностики или типирования онкологических заболеваний. 1.2 Созданная аналитическая тест-система должна быть предназначена для диагностики рака предстательной железы и прогноза чувствительности к доцетакселу при гормонорезистентном раке предстательной железы на основе определения уровня пула циркулирующих в плазме крови микроРНК методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. 1.3 Разработать программу для ЭВМ, позволяющую интерпретировать результаты работы аналитической тест-системы, в том числе позволять диагностировать рак предстательной железы и прогнозировать чувствительность опухоли к доцетакселу при гормонорезистентном раке предстательной железы.

Основные планируемые результаты проекта:
Для успешной реализации проекта необходимо решение следующих задач:
1) Провести аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ.
2) Провести патентные исследования по ГОСТ 15.011-96.
3) Разработать методику получения плазмы крови, позволяющую минимизировать выход нуклеиновых кислот из форменных элементов крови.
4) С использованием разработанной методики, сформировать коллекции плазмы крови пациентов следующих групп условно здоровые доноры, пациенты с доброкачественной гиперплазией предстательной железы, пациенты с неметастатической формой рака предстательной железы, пациенты с метастатической формой рака предстательной железы, пациенты с гормонорезистентной формой РПЖ чувствительные к терапии доцетакцелом, пациенты с гормонорезистентной формой РПЖ резистентные к терапии доцетакселом.
5) Разработать методику выделения циркулирующих в плазме крови некодирующих РНК.
6) Провести высокопроизводительный анализ миРНома, сформированной коллекции плазмы крови.
7) Осуществить биоинформационный анализ полученных результатов. Выбрать значимые для диагностики рака предстательной железы и прогноза чувствительности к доцетакселу при гормонорезистентном раке предстательной железы микроРНК и разработать на их основе математическую модель. Провести сравнительный анализ и выбрать референсные молекулы для нормировки результатов.
8) Разработать программу для ЭВМ, реализующую разработанную математическую модель.
9) Подтвердить клиническую значимость выявленных микроРНК на охарактеризованной методами высокопроизводительного анализа миРНома коллекции биологических образцов.
10) Обосновать выбор и разработать лабораторный регламент изготовления набора реагентов для определения уровня значимых микроРНК в плазме крови методом ПЦР.
11) Изготовить 100 шт. экспериментальных образцов аналитической тест-системы.
12) Повести испытания экспериментальных образцов аналитической тест-системы по разработанной Программе и методикам испытаний.
13) Разработать проект инструкции по применению аналитической тест-системы.
14) Разработать проект технического задания на проведение ОКР: «Разработка многопараметрической диагностической тест-системы для диагностики рака предстательной железы и персонифицированного выбора химиотерапии».

Экспериментальная разработка методики получения плазмы крови, позволяющей минимизировать выход нуклеиновых кислот из форменных элементов крови будет разработана на основе одного из наборов реагентов для выделения малых некодирующих РНК: mirVana PARIS kit (Cat nuAM1556, Ambion, Life Technologies, Texas, USA, TRIzol-LS (Cat nu10296010, Ambion, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA ) или miRNeasy Serum/Plasma Kit (Cat nu.217184. Qiagen, Hilden, Germany).
Высокопроизводительный анализ миРНома будет осуществляться на платформе Scanner 3000 7G (Affymetrix, США) с помощью чипов высокой плотности для анализа миРНома (GeneChip miRNA 4.0 Array).
Методика оценки уровня микроРНК будет разработана на основе одного из из следующих вариантов: Looped RT primer и TaqMan probes; PolyA-tail и SYBR Green; PolyA-tail, LNA и SYBR Green.
В рамках доклинической валидации аналитической тест-системы предполагается широкое использование ксенографтных моделей рака предстательной железы (клеточные линии PC3, DU145), разработанных проф. Удо Шумахером [1].
В рамках разработки математической модели для аналитической тест системы будет использован способ повышения достоверности классификации за счет метода отбора транскриптов [2], позволяющего снизить количество транскриптов благодаря оптимизации совокупной информативности результирующего набора вместо использования ранжирования по индивидуальной информативности. Следует отметить, что при этом для настройки классификатора будет использован более мощный по сравнению с традиционно используемыми центроидами [3] аппарат SVM (метод опорных векторов, [4]).
Возможности обеспечить выбор глобально наиболее информативной совокупности микроРНК методом полного перебора нет даже при использовании суперкомпьютерных технологий (общее число вариантов составляет не менее 260, а обычно значительно превышает 2100, при этом рассмотрение каждого из вариантов является отнюдь не атомарным действием), однако есть возможность ослабления эвристик, используемых при оптимизации, что позволит построить диагностические и предиктивные тест-системы, предоставляющие более достоверную информацию для диагностики и выбора терапии при раке предстательной железы.
Ключевыми отличиями предлогаемого нами метода от существующих аналогов являются оптимизация совокупной информативности набора транскриптов вместо использования транскриптов с наибольшей индивидуальной информативностью, а также ослабление эвристик / увеличении числа реализаций в методах типа Монте Карло, используемых при отборе набора транскриптов. Для построения эффективных алгоритмов построения тест-системы будут определены функционалы, формализующие понятие совокупной информативности набора транскриптов, предложены подходы к их оптимизации, а также проанализированы возможные методы машинного обучения, которые будут использоваться для построения классификаторов. Кроме этого, будет разработан аппарат для сопоставления эффективности (достоверности) тест-систем с общим назначением. Предполагается изучить возможность эффективного применения как различных модификаций так называемых жадных алгоритмов (в частности, возвратных жадных алгоритмов, а также жадных алгоритмов с неединичной глубиной шага – см., в частности, [5]), так и направленных на построение редких представлений (sparse representations) методов l1-минимизации [6]. Спектр методов машинного обучения, который планируется рассмотреть, включает, помимо метода опорных векторов [4] и логистической регрессии [7], методы кластерного анализа [8], решающих деревьев [9], а также некоторые генетичские подходы к оптимизации [10].
Список использованной литературы:
1) Lange T. и др. Human prostate cancer in a clinically relevant xenograft mouse model: identification of β(1,6)-branched oligosaccharides as a marker of tumor progression. // Clin. Cancer Res. 2012. Т. 18. № 5. С. 1364–73.
2) В.В. Галатенко и др. (2013) О построении медицинских тест-систем с использованием жадного алгоритма и метода опорных векторов // БЭБиМ, 156 (11), 654-658.
3) R. Tibshirani et al. (2002) Diagnosis of multiple cancer types by shrunken centroidsof gene expression // Proc. Natl. Acad. Sci USA, 99 (10): 6567-6572.
4) C. Cortes, V. Vapnik (1995) Support-vector networks // Machine Learning, 20 (3): 273-297.
5) Е.Д. Лившиц (2006) О Возвратном жадном алгоритме // Изв. РАН, Сер. Матем, 70 (1), 95-116.
6) D.L. Donoho, M. Elad (2003) Optimally sparse representation in general (nonorthogonal) dictionaries via l1 minimization // PNAS, 100 (5), 2197–2202.
7) D.W. Hosmer, S. Lemeshow Applied Logistic Regression.
8) И.Д. Мандель Кластерный анализ.
9) L. Breiman et al. Classification and Regression Trees.
10) R.R. Bies et al. A Genetic Algorithm-Based, Hybrid Machine Learning Approach to Model Selection.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Основными Научно- техническими результатами ПНИ будут:
- результаты теоритических изысканий;
- результаты патентных исследований;
- методика получения плазмы крови, позволяющую минимизировать выход нуклеиновых кислот из форменных элементов крови.
- математическая модель, позволяющая диагностировать рак предстательной железы, а также определять чувствительность к доцетакселу гормонорезистентного рака предстательной железы, по уровню циркулирующих в плазме крови человека микроРНК.
- программа для ЭВМ, позволяющая диагностировать рак предстательной железы, а также определять чувствительность к доцетакселу гормонорезистентного рака предстательной железы, по уровню циркулирующих в плазме крови человека микроРНК и референсных молекул, определенных методом ПЦР-РВ.
- экспериментальные образцы набора реагентов для оценки уровня микроРНК в плазме крови.
- проект технического задания на проведение ОКР «Разработка многопараметрической диагностической тест-системы для диагностики рака предстательной железы и персонифицированного выбора химиотерапии»;
- рекомендации по реализации результатов ПНИ в реальных секторах экономики.
Результаты ПНИ предназначены для применения в лабораторной диагностике рака предстательной железы (РПЖ), персонифицированного лечения гормонорезистентной формы РПЖ.
После завершения необходимого объема клинических испытаний разработанная аналитическая тест-система станет методом выбора для малоинвазивной диагностики РПЖ, сможет заменить травматичную процедуру биопсии предстательной железы.

Текущие результаты проекта:
В рамках первого этапа проекта за счет бюджетных средств выполнены следующие работы:
- подготовлен обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы в области научно-технической проблемы, исследуемой в рамках ПНИ;
- проведены патентные исследования;
- осуществлена экспериментальная разработка методики получения плазмы крови, позволяющая минимизировать выход нуклеиновых кислот из форменных элементов крови;
- создана коллекция плазмы крови пациентов, в том числе: условно здоровых доноров, пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы, пациентов с неметастатической формой рака предстательной железы, пациентов с метастатической формой рака предстательной железы, пациентов с гормонорезистентной формой РПЖ чувствительные к терапии доцетакцелом, пациентов с гормонорезистентной формой РПЖ резистентные к терапии доцетакселом;
- выполнено сравнительное исследование протоколов выделения циркулирующих в плазме крови микроРНК. Выбран оптимальный протокол выделения микроРНК.

За счет внебюджетных средств выполнены следующие работы:
- организована испытательная лаборатория;
- выполнен поиск вариантов технических решения набора реагентов для определения уровня микроРНК в плазме крови, с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера;
- подготовлено технико-экономическое обоснование разработки аналитической тест-системы;
- проведено сравнительное исследование профиля некодирующих РНК в опухолевой ткани и плазме крови.