Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка диагностической панели для прогнозирования патологических состояний у людей, страдающих алкоголизмом или патологиями, ассоциированными с регулярным приемом алкоголя, методом метагеномного профилирования микробиоты кишечника человека.

Докладчик: Ильина Елена Николаевна

Должность: Заведующий лабораторией

Цель проекта:
Разработка диагностической панели, позволяющей определять таксономический и функциональный состав микробиоты кишечника человека и использовать полученные данные для прогнозирования развития патологических состояний у людей, страдающих алкоголизмом или патологиями, ассоциированными с регулярным приемом алкоголя.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Проведение патентных исследований по теме научно-исследовательской работы.
Поиск патентной информации по проекту будет проводиться в патентных базах данных Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Российской Федерации (Роспатент, www.fips.ru), Бюро по патентам и товарным знакам США (USPTO, www.uspto.gov) и Европейского патентного бюро (EPO, ep.espacenet.com)

2. Разработка вариантов диагностической панели, совместимых с современным оборудованием для ПЦР анализа.
Данная задача опирается на создание базы олигонуклеотидных последовательностей (маркеров), специфичных для бактериальных таксонов уровня вида и выше, а также отдельных групп генов, в частности, генов токсинов. Маркеры будут выделены из базы последовательностей геномов и генов микробиоты кишечника человека и использованы в качестве шаблонов для зондов диагностической панели. Данный подход будет устойчив к непостоянству генного состава в пределах таксона и нуклеотидным заменам в пределах гена. Он позволит оценить как таксономический состав микробиоты, так и генный - по функциям, имеющим отношение к патогенезу заболеваний, ассоциированных с систематическим приемом алкоголя. Диагностическая панель будет изготовлена в формате, совместимом с существующим лабораторным оборудованием для ПЦР анализа в режиме реального времени. Диагностическая панель позволит выявить не менее 1000 бактериальных маркеров.

3. Создание программного обеспечения для клинического анализа результатов, полученных с помощью диагностической панели.
Данная задача включает в себя создание программного обеспечения, предназначенного для использования специалистом-врачом. Комплекс должен реализовывать функции: нормализации и оценки качества данных, полученных с использованием диагностической панели; статистического анализа, включающего оценку степени риска заболеваний, ассоциированных с систематическим употреблением алкоголя, в виде, удобном для интерпретации специалистом-врачом в целях диагностики.

4. Создание базы данных, содержащей информацию о бактериальных маркерах, имеющих значение для патогенеза заболеваний, ассоциированных с систематическим приемом алкоголя.
Данная задача решается на основании сбора в литературных источниках информации о взаимосвязи таксономического и функционального состава микробиоты человека с заболеваниями, ассоциированных с систематическим приемом алкоголя. Будет создана единая база, содержащая собранные сведения по бактериальным маркерам, ассоциированным с ними заболеваниям, с указанием типа метагеномного исследования (полногеномное секвенирование или секвенирование последовательностей гена 16S рРНК).

5. Формирование биобанка микробиоты кишечника здоровых людей и пациентов с патологией, ассоциированной с систематическим приемом алкоголя.
Для решения этой задачи будет произведен забор 150 образцов кала у пациентов, имеющих клинически подтвержденный диагноз наиболее социально значимых заболеваний, ассоциированных с систематическим приемом алкоголя. Микробиота здоровых людей будет представлена не менее чем 100 образцами кала.

6. Разработка методов выделения ДНК из биологических образцов и пробоподготовки для анализа микробиоты кишечника человека с помощью диагностической тест-системы.
Данная задача направлена на снижение затрат реагентов и времени при пробоподготовке, а также снижение требований к количеству биологического образца. Определение таксономического и функционального состава микробиоты кишечника требует относительно высоких количеств ДНК (до 0,5-1,5 микрограммов). На основании широко применяемых методов выделения ДНК из кала человека будет создан оптимизированный протокол, который может быть воспроизведен в условиях клинической лаборатории без затрат на дополнительное оборудование.

7. Экспериментальное сравнение разработанных схем диагностической панели и выбор наилучшего варианта.
Для решения данной задачи будет проведено экспериментальное сравнение результатов, полученных с помощью диагностических панелей, изготовленных по всем разработанным схемам, и полногеномного секвенирования на не менее чем 30 образцах кала. В качестве окончательного варианта для клинического использования будет отобрана реализация диагностической панели, которая будет обеспечивать максимальную корреляцию филогенетического и функционального состава микробиоты с результатами полногеномного секвенирования по тем же образцам.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Основными потребителями создаваемой диагностической панели будут являться научно-клинические учреждения здравоохранения, специализированные лечебно-профилактические учреждения, учреждения высшего профессионального образования и науки.
Основным индустриальным партнером по данному проекту является ООО НПФ «Литех». Компания оснащена самым современным оборудованием и обладает всеми необходимыми средствами для проведения анализа с использованием предлагаемой тест-системы.
Направления деятельности ООО НПФ «Литех» включают:
- Научные исследования, направленные на разработку новых технологий для диагностики социально-значимых заболеваний человека;
- Производство тест-систем для ИФА и ПЦР диагностики.
Внедрение диагностической тест-системы позволит расширить ассортимент производимой продукции и улучшить её характеристики.

Результаты исследования будут опубликованы в научных журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных "Сеть науки" (WEB of Science). Кроме этого, планируется доложить результаты на тематических конференциях, как российских, так и международных.

Текущие результаты проекта:
На текущий момент получены следующие результаты проекта:
1. Обзор научно-технической литературы. В обзоре литературе представлена современная информация о различных типах бактериальных маркеров. Обзор составлен на основе научных статей, преимущественно опубликованных за последние 5 лет.

2. Отчет о выполнении патентных исследований. Проведены патентные исследования по теме НИР, с использованием ключевых слов, заявленных в теме. На текущий момент разрабатываемая модель диагностической панели не нарушает ни одного из найденных патентов.

3. Отчет о проведении сравнительной оценки эффективности возможных направлений исследований. Завершено проведение сравнительной оценки эффективности возможных направлений исследований. При оценке эффективности возможных направлений исследования учитывалась возможность приборной базы потенциальных потребителей диагностической тест-системы и время, необходимое на проведение анализа.

4. Отчет с результатами возможных вариантов решения задачи с обоснованием выбранного варианта. Были рассмотрены возможные подходы к решению задач, поставленных в исследовании и отобраны варианты, позволяющие получить достоверные результаты при использовании диагностической панели с учетом специфики оборудования клинической лаборатории и квалификации ее работников.

5. Отчет о проведении сравнительной оценки вариантов возможных решений исследуемой проблемы с учетом результатов прогнозных исследований, проводившихся по аналогичной тематике. Были изучены и сравнены между собой различные варианты решения похожих задач, поставленных в рамках ПНИ. Из изученных вариантов были отобраны оптимальные для работы в рамках реализации ПНИ

6. Акт о создании банка образцов микробиоты кишечника. Было собрано 20 контрольных образцов и кала человека и 30 образцов кала людей, с алкоголизмом, или ассоциированными с ним патологиями.

7. Критерии включения и исключения пациентов из исследования. На основе литературных данных, указывающих на факторы, которые могут оказать влияние на состав микробиоты кишечника были разработаны критерии включения и исключения пациентов из исследования.

8. Отчет о разработке системы контроля качества образцов микробиоты кишечника человека. На основе рекомендаций международных метагеномных консорциумов была разработана система контроля качества образцов микробиоты кишечника человека.

9. Отчет о разработке методики подготовки и хранения биологических образцов. На основе рекомендаций международных метагеномных консорциумов были разработаны методики подготовки и хранения образцов кала человека, учитывающие приборную базу клинической лаборатории.
10. Разработка вариантов диагностической панели. Было разработано 2 варианта диагностической панели на основе ПЦР в режиме реального времени.
11. Было проведено полногеномное секвенирование 50 образцов (первой стадии) микробиоты кишечника человека.
12. При участии индустриального партнера были синтезированы праймеры для генов функциональных и филогенетических бактериальных маркеров маркеров.
13. Была создана база данных, содержащей информацию о генах бактериальных токсинов и генах, ассоциированных с метаболизмом алкоголя
14. Материалы работ были представлены на международной конференции Postgenome-2014 в Казани.