Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка методов получения модифицированных высокоаффинных ДНК-аптамеров и создание на их основе нового эффективного средства для противоопухолевой терапии

Докладчик: Фролова Елена Ивановна

Должность: заведущий Группой экспрессии белковых факторов роста и дифференцировки, Заведующий группой экспрессии белковых факторов роста

Цель проекта:
1. Разработка нового функционального инструментария, позволяющего быстро и эффективно получать олигонуклеотидные соединения, сильно и избирательно связывающие наиболее востребованные биологические мишени – высокогликозилированные секретируемые белки и белки, расположенные на поверхности клеток. 2. Получение и систематизация новых практических данных о влиянии функциональных групп, присоединенных к гетероциклическим основаниям дезоксинуклеозидтрифосфатов и линкеров, используемых для такого присоединения на способность модифицированных дезоксинуклеозидтрифосфатов специфично взаимодействовать с гликозилироваными формами белков, а также выступать в качестве субстрата в ходе ПЦР. 3. Создание нового терапевтического средства – противоопухолевого ДНК-аптамера на основе модифицированных нуклеотидов, нацеленного на высокогликозилированный рецептор, присутствующий на поверхности опухолевых клеток. Терапевтическое средство должно обладать большей эффективностью, за счет большей аффинности и специфичности в отношении своей мишени, чем разрабатываемые аналоги - моноклональные, а также большей биодоступностью и равной или превосходящей аналоги стабильностью в биологических жидкостях. 4. Разработка методических подходов для проведения противораковой терапии с использованием модифицированных ДНК-аптамеров, определение оптимальных схем и условий применения, учитывающих особенности строения и метаболизма этого класса соединений.

Основные планируемые результаты проекта:
Выполнение работ, составляющих предлагаемый проект, приведет к получению следующих результатов:
Будет разработана и испытана новая технология получения модифицированных нуклеозидтрифосфатов с присоединенными к гетероциклическим основаниям функциональными группами, обладающих высокой аффинностью к полисахаридам, в том числе, составляющим гликозидную часть белка. Будет определена структура функциональной группы и длина линкера, соединяющего ее с нуклеозидом, обеспечивающие максимальное сродство модифицированного нуклеозида к полисахаридам с сохранением его способности являться субстратом для термостабильной ДНК-полимеразы. В совокупности эти два результата составят основу нового мощного инструмента для получения высокоаффинных амплифицируемых лигандов, обладающих избирательным сродством к гликозилированным мишеням, в частности, секретируемым белкам – гормонам и цитокинам, а также поверхностным белкам-рецепторам. Эти группы белков наиболее часто выступают в роли мишеней при поиске новых лекарственных средств для терапии метаболических расстройств, онкопатологий, моно-и полигенных заболеваний.
Также в результате выполнения предлагаемого проекта будет создано новое эффективное средство для терапии широкого спектра злокачественных заболеваний – блокирующий ДНК-аптамер против поверхностного рецептора CD47. Полученный терапевтический аптамер будет обладать высокой стабильностью в биологических жидкостях, не меньшей или превосходящей таковую у моноклональных антител, более высокой афинностью к CD47 и, как следствие, меньшей эффективной дозировкой при системном применении, а также существенно более высокой биодоступностью вследствие примерно 50-кратной разницы в размерах молекул (~3 kDa для 60-нуклеотидного ДНК-аптамера в сравнении с 150 kDa для моноклонального антитела).
Еще одним результатом выполнения проекта будет получение систематических сведений о влиянии структуры функциональных групп, содержащих ароматические бороновые кислоты, и длины линкеров на способность этих функциональных групп эффективно связывать полисахариды в составе гликозилированных белков, находясь в составе модифицированного ДНК-аптамера и при этом не интерферируя с ферментативной амплификацией самого аптамера. Такие сведения облегчат дальнейшую разработку иных модифицированных нулкеозидтрифосфатов, обладающих избирательным сродством к другим классам мишеней.
Будет также проведен комплекс испытаний, включающий в себя опыты in vitro, ex vivo и in vivo для выработки наиболее эффективных методик проведения противораковой терапии с использованием ДНК-аптамеров в качестве терапевтических агентов. Будут разработаны терапевтические схемы и рекомендации по применению, учитывающие структурные и функциональные особенности ДНК-аптамеров, отличающие их от прочих используемых в настоящее время химиотерапевтических средств.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Результатом проекта, обладающим наибольшей степенью готовности к фактическому применению, а также выраженным положительным социально-экономическим эффектом является терапевтический противоопухолевый ДНК-аптамер против рецептора CD47. Предполагается, что анти-CD47-терапия будет обладать достоверной эффективностью как в составе монотерапии, что подтверждается в ходе экспериментов на мышиных моделях с использованием менее эффективных, чем ДНК-аптамеры блокирующих агентов – моноклональных антител, так и в составе комплексной химиотерапии в роли адъювантного средства. В этом случае ожидается возникновение синергического эффекта от применения химических агентов – цитостатиков, непосредственно угнетающих пролиферацию опухолевых клеток и анти-CD47-препаратов, позволяющих иммунной системе пациента эффективно атаковать опухолевые клетки. Таким образом, после проведения необходимых клинических испытаний терапевтический аптамер может быть введен в клиническую практику непосредственно в составе уже существующей комплексной химиотерапии. Одновременно с этим терапевтический ДНК-аптамер за счет своей более высокой биодоступности, меньшей иммуногенности и ожидаемого более высокого сродства к белку-мишени будет обладать рядом преимуществ по сравнению с функциональными аналогами – моноклональными антителами, которые разрабатываются в настоящее время за рубежом. Другим важным конкурентным преимуществом терапевтического аптамера является существенно более низкая стоимость производства и высокая стабильность в широком диапазоне температур. Такие характеристики дополнительно облегчат внедрение нового терапевтического средства в медицинскую практику и обеспечат возможности для его максимально широкого применения.
Разработанные в ходе выполнения проекта новые методики синтеза модифицированных нуклеозидтрифосфатов, обладающих высокой аффинностью к гликозилированным белкам будут активно востребованы и использованы индустриальным партнером – производителем модифицированных олигонулеотидов для создания готового инструментария в поиске новых модифицированных ДНК-аптамеров, обладающих как диагностическим потенциалом в качестве компонентов биосенсоров, тест-систем для определения содержания исследуемых белков, так и терапевтическим в качестве отдельных препаратов или в структуре более сложных лекарственных средств для направленной доставки действующего вещества в ткани-мишени.
Практические сведения о влиянии функциональных групп и соединяющих их линкеров на свойства модифицированных нуклеозидтрифосфатов и эффективность модифицированных ДНК-аптамеров будут опубликованы и востребованы в ходе разработки новых модификаций нуклеозидтрифосфатов для использования в составе амплифицируемых аффинных реагентов, обладающих повышенным сродством к специфическим группам мишеней как организацией-индустриальным партнером, так и другими научными и производственными коллективами.
Коллективы, занимающиеся разработкой новых лекарственных препаратов также могут успешно использовать полученные в ходе выполнения проекта результаты испытаний терапевтической эффективности ДНК-аптамера и выявленные особенности его применения в ходе противораковой терапии.

Текущие результаты проекта:
Выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ. Проведены патентные исследования, сравнительная оценка эффективности возможных направлений исследований, разработаны варианты возможных решений задачи, проведен выбор и обоснование оптимального варианта решения задачи.
Определены структуры дезоксинуклеозидтрифосфатов с функциональными группами на гетероциклических основаниях, позволяющие при их использовании получать в ходе ПЦР фрагменты модифицированных ДНК с функциональными группами на гетероциклических основаниях, которые способны аффинно (специфично) взаимодействовать с молекулярными мишенями. Выбраны схемы и методы синтеза определенных структур дезоксинуклеозидтрифосфатов с функциональными группами на гетероциклических основаниях и проведена разработка лабораторных методик получения дезоксинуклеозидтрифосфатов с функциональными группами на гетероциклических основаниях. Проведен синтез экспериментальных образцов дезоксинуклеозидтрифосфатов с функциональными группами на гетероциклических основаниях, различающиеся химическим строением функциональной группы и химическим строением линкера, связывающего функциональную группу с гетероциклическим основанием, проведена проверка полученных образцов на способность участвовать в реакции полимеризации ДНК в ходе ПЦР с использованием ДНК-полимераз, принадлежащих к разным семействам, определена оптимальная структура и длина линкера, соединяющего функциональную группу с гетероциклическим основанием. Отобрана ДНК-полимераза и определен состав смеси для оптимального проведения ПЦР с дезоксинуклеозидтрифосфатами с функциональными группами на гетероциклических основаниях. Проведена проверка способности отобранных соединений взаимодействовать с олигосахаридами. Определено соединение, сохраняющего наибольшую аффинность. Проведен выбор схем и методов проведения ПЦР с дезоксинуклеозидтрифосфатами с функциональными группами на гетероциклических основаниях, в том числе метода контроля. Проведена наработка экспериментальных образцов амплифицируемых аффинных реагентов на основе ДНК с функциональными группами на гетероциклических основаниях с использованием различных ДНК-полимераз, различных схем и методов проведения ПЦР с контролем.