Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка биомедицинского препарата гемопоэтических стволовых клеток для персонифицированной протеом-основанной терапии опухолей головного мозга

Докладчик: Хотимченко Юрий Степанович

Должность: Директор Школы биомедицины, директор Школы биомедицины

Цель проекта:
1. Лечение злокачественных опухолей головного мозга одна из самых сложных междисциплинарных научных проблем: медиана выживаемости больных с наиболее распространенными первичными опухолями головного мозга составляет 12 - 14 месяцев, с вторичными (метастатическими) опухолями 12 - 16 месяцев. Крайне низкая эффективность объясняется высокой степенью инфильтрации паренхимы мозга опухолевыми клетками, и особыми свойствами опухолевых стволовых клеток (ОСК). Классические противоопухолевые препараты не способны эффективно воздействовать на интерфазные опухолевые клетки рассеянные в паренхиме мозга, а препаратов способных эффективно уничтожать ОСК сегодня не существует. Множество данных позволяет считать ОСК продуктом патологической эволюции соматических стволовых клеток организма человека, вызванной воздействием канцерогенных факторов. Эволюционные преимущества делают ОСК не чувствительной к терапии, поскольку на любое деструктивное воздействие ни отреагирует формированием резистентных клеточных клонов. Требуется принципиально новый инструмент для воздействия на этот ОСК. Феномен направленной миграции стволовых клеток в опухолевый очаг открывает возможности создания принципиально новых, противоопухолевых биомедицинских клеточных препаратов способных преодолеть гематоэнцефалический барьер, воздействовать на интерфазные опухолевые клетки, рассеянные в паренхиме мозга и проникать в гипоксические зоны опухоли, содержащие ОСК. Использование собственных гемопоэтических стволовых клеток пациента с ремоделированным протеомным профилем позволит создать технологию целью которой является не только тотальное уничтожение опухолевых клеток, но управление ключевыми (репаративными и пролиферативными) функциями ОСК. 2. Целью реализуемого проекта является изучение процессов направленной миграции гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) человека к опухолевым клеткам in vitro и in vivo, изучение способности ГСК человека подавлять рост опухолевых клеток vitro и in vivo, изучение возможности управления ключевыми функциями ОСК, изучение особенностей межклеточного взаимодействия ГСК с индуцированным апоптозом с опухолевыми клетками vitro и in vivo, проведение сравнительного протеомного картирования и профилирования нейральной стволовой клетки, мультипотентной мезенхимальной стромальной клетки костного мозга и опухолевых стволовых клеток первичных и метастатических опухолей головного мозга, подбор оптимальных терапевтических агентов и идентификацию путей внутриклеточной сигнальной трансдукции для управления ключевыми (регенеративными и репродуктивными) функциями опухолевых стволовых клеток; конечным продуктом проекта является технология высокоэффективного, персонифицированного, таргетного воздействия на ключевые функции ОСК злокачественных опухолей мозга с помощью аутологических ГСК с ремоделированным протеомом; разработка технологии воздействия на ОСК пациента с учетом персональной особенностей его опухоли повысит эффективности химиотерапевтического лечения и улучшит показатели выживаемости и качества жизни онкологических больных.

Основные планируемые результаты проекта:
1. В ходе выполнения проекта планируется разработать экспериментальную модель неопластического процесса в головном мозге; дать экспериментальное обоснование феномену направленной миграции стволовых клеток в неопластический очаг; доказать, что основным источником хемокинов привлекающих стволовые клетки являются не только дегенерирующие ткани но и собственно опухолевые клетки; будет показано, что основным механизмом противоопухолевого межклеточного взаимодействия между ГСК и неопластическими клетками является обмен межклеточными белками угнетающими неопластическую пролиферацию, и "эффект свидетеля" или феномен передачи межклеточной информации известный в англоязычной литературе как "by stander effect"; обоснованна возможность управления регуляторным сигналом ГСК; разработана инновационная стратегия персонифицированной клеточной терапии злокачественных опухолей головного мозга основанная не только на тотальном уничтожении опухолевых клеток, но и управлении репродуктивными и пролиферативными функциями ОСК; впервые будут опубликованы сравнительные протемные профили нейральных стволовых клеток (НСК) человека, гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) человека и ОСК выделенных из первичных и метастатических опухолей головного мозга человека, а также показаны их принципиальные протеомные различия; впервые в мировой практике будут созданы протеом-модифицированные клеточные системы для терапии опухолей головного мозга. Основываясь на сравнительном протеомном картировании будут выявлены белки - мишени клеточной поверхности ОСК пригодные для таргетного воздействия на внутриклеточные сигнальные пути, не подвергшихся неопластической трансформации опухолевым процессом. С использованием методов биоинформационного анализа и компьютерного моделирования, будет продемонстрирована техника диагностики белков – партнеров в базах данных белок-белковых взаимодействий, способных активировать функционально значимые внутриклеточные пути и выступать в качестве белков-лигандов процессах межклеточного взаимодействия ОСК и ГСК. Будет проведено экспериментальное обоснование и разработана стратегия применения протеом-персонифицированной клеточной терапии в комплексном лечении опухолей головного мозга.
2. Основным планируемым результатом является уникальная технология персонифицированной клеточной терапии злокачественных новообразований головного мозга с учетом уникальных молекулярно-биологических (транскриптомно-протеомных) особенностей ОСК конкретного пациента. Биологическая информация, полученная путем транскриптомного и протеомного анализа является наиболее достоверной и объективной, поэтому биомедицинские клеточные препараты, изготовленные на базе этой биологической информации имеют отчетливый вектор индивидуальности для каждого конкретного пациента с учетом персональных особенностей его опухоли. Исследование обеспечит широкое внедрение постгеномных технологий в клиническую практику, установление устойчивых междисциплинарных связей между фундаментальной нейробиологией и клинической медициной. Выявленные различия протеомной структуры ОСК от нейральных стволовых клеток и ГСК будут использованы для более точной диагностики злокачественной опухоли и оценки её метастатического потенциала.
3. В работе будут использованы самые современные научно-технологические решения: моделирование опухоли будет выполнено с использованием стереотаксического навигационного оборудования для экспериментальной хирургии под контролем магнитно-резонансной томографии; культивирование стволовых и опухолевых клеток будет проведенго с использованием системы Сompact Select в автоматическом режиме, моделирование опухоли будет произведено с помощью высокоточного дозатора и микроинфузора; Получение ГСК из периферической крови пациента будет выполнено партнерами Школы биомедицины с помощью аппарата COBE®Spectra Apheresis System, Сортировку клеток CD34+фенотипа осуществляется методом иммуномагнитной сепарации на разделительной колонке AutoMACS Pro™ с использованием специализированных наборов реагентов; исследование процессов направленной миграции стволовых клеток in vitro , будет выполнено в полностью автоматическом режиме с использованием установки Cell IQ и дополнено методиками высокоточной электронной микроскопии; изучение процессов направленной миграции и противоопухолевого взаимодействия ГСК будет выполнено на живом объекте с использованием методов и установок мультифотонной сканирующей лазерной микроскопии и флуоресцентных витальных трейсеров неразрывно связанных с белками цитоплазмы. Серия экспериментов сравнительного протеомного картирования и профилирования лизатов: а) нейральных (CD133+) стволовых клеток, выделенных из обонятельной выстилки носа человека; б) мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD34-), полученных из костного мозга человека; в) опухолевых (CD 133+) стволовых клеток, изолированных из культуры клеточной линии U87 глиобластомы человека будет выполнена с использованием методов гель-электрофореза, жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.Для белков, присутствующих во всех трех протеомах, в автоматическом режиме,c использованием мощного сервера, помощью баз данных PubMed, PANTHER, Gene Ontology и KEGG должно быть проведено аннотирование биологических процессов, молекулярных функций, клеточной локализации и сигнальных путей белков.
4. Основными конкурентами являются Лаборатория Эвана Снайдера (Sanford Burnham Medical Research Institute, CША,) и лаборатория Карен Эбоди (National Cancer Institute, США). Однако главным направлением проводимых исследований является использование ГСК как транспортного посредника для адресной доставки терапевтических генов и неактивных форм химиотерапевтических веществ к очагу опухоли в головном мозге. Заявляемый ДВФУ проект абсолютно уникален, поскольку основан на транскриптомно-протеомных особенностях ОСК конкретного пациента.
5. Способом достижения результатов является масштабное использование потенциала центров коллективного пользования, кооперация с ведущими онкологическими центрами и клиниками России, использование уникального научного оборудования. Возможными ограничениями (потенциальный риск) является рост цен на расходные материалы и комплектующие и зависимость от партнеров в предоставлении человеческого материала для исследований.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Основной областью применения результатов является онкология

2. Технология получит широкое внедрение в комплексной терапии злокачественных опухолей головного мозга.Безусловно, стандарт лечения первичных и метастатических опухолей должен включать хирургическую операцию, облучение и химиотерапию с обязательным применением современных таргетных препаратов для коррекции генетических нарушений и эпигенетических сбоев, культур цитотоксических лимфоцитов и индивидуализированных противоопухолевых вакцин. Создание клеточных биомедицинских препаратов для направленного воздействия на ОСК приведет к повышению эффективности конвенционных методов лечения и существенно продлит жизнь онкологических больных. Предлагаемая стратегия персонифицированной клеточной терапии является логическим продолжением существующих в современной онкологии конвенциональных подходов. Она является завершающим этапом противоопухолевого лечения и проводится после завершения циторедуктивного, цитостатического, цитотоксического лечения, а также после курса иммунотерапии как основной инструмент регуляции и контроля функционирования опухолевых стволовых клеток (ОСК).
3. На отечественном рынке будет представлена уникальная научная технология воздействия на ОСК злокачественного новообразования конкретного пациента; разработана новая технологическая платформа применения клеточных технологий в нейроонкологии; предполагается создать уникальную мкждународную научно-практическую лабораторию для производства персонифицированных клеточных препаратов для лечения опухолей головного мозга и других злокачественных новообразований.

Текущие результаты проекта:
1. Проведенный анализ научной литературы, который позволяет сделать вывод об опухолевых стволовых клетках (ОСК) как основной причине терапевтической резистентности опухолей головного мозга и стратегических свойствах ОСК: мультипотентности, способность к неограниченному самообновлению благодаря экспрессии теломеразы, гипоксическом тип метаболизма, локализация в гипоксических зонах новообразования, способности восстанавливать поврежденную ДНК и синтезировать ферменты выводящие химиотерапевтические вещества из клетки; систематизированы факты свидетельствующие в пользу происхождения ОСК первичных опухолей головного мозга от собственных нейральных стволовых и прогениторных клеток головного мозга человека;Собраны аргументы в пользу происхождения ОСК метастатических новообразований мозга по средствам эпителиально-vезенхимального перехода; Выявлены ключевые гены, идентифицированы эпигенетические механизмы, установлены основные пути внутриклеточной сигнальной трансдукции управляющие процессами канцерогенеза в мозге; идентифицированы основные лиганды и ключевые рецепторы управляющие процессами направленной миграции стволовых клеток в зону неопластического, ишемического или травматического повреждения в головном мозге;на основании проведенных научно-теоретических изысканий сформулирована концепция создания персонифицированного противоопухолевого клеточного препарата на базе технологий клинической онкопротеомики.
2. Обоснованы направления исследований и способы решения поставленных задач.
3. Разработана экспериментальная модель неопластического процесса в головном мозге экспериментальных животных. Установлено, что имплантация 1 миллиона клеток глиомы линии С6 в головной мозг взрослых половозрелых крыс линии Вистар приводит к развитию инвазивных опухолей. Смоделированная опухоль характеризуется инвазивным ростом, выраженной инфильтрацией паренхимы мозга опухолевыми клетками, выраженной атипией клеток, пролиферацией эндотелия кровеносных сосудов, ангигенезом, митозами и множественными некрозами, что наиболее полно соответствует мультиформной глиобластоме человека. Рост опухоли способствует активизации микроглии и выраженной астроглиальной реакцией. Опухоль хорошо визуализируется с помощью магшнитно-резонансной томографии, характеризуется поражением белого вещества полушарий, распространением на базальные ганглии и желудочки мозга, выраженным отеком и внутричерепной гипертензией. Средняя продолжительность жизни животного с опухолью 31, 2± 12 дней.
4. Разработана лабораторная технологии изучения процессов противоопухолевого взаимодействия ГСК in vitro. Изучены особенности и специфические механизмы противоопухолевого взаимодействия ГСК и опухолевых клеток. Доказано, что при совместном культивировании с клетками глиомы С6 и глиобластомы человека линии U87 ГСК активно взаимодействуют с опухолевыми клетками и обмениваются регуляторными цитоплазматическими белками которые ингибируют опухолевую пролиферацию и отодвигают во времени фазу логарифмического роста опухолевой культуры.
5.Разработана лабораторная технология изучения процессов направленной миграции стволовых клеток in vivo. ГСК введенные экспериментальному животному в переопухолевое пространство активно взаимодействуют с неопластическими клетками,а при введении в противоположное полушарие или системный кровоток направленно мигрируют в опухолевый очаг, где взаимодействуют с опухолевыми клетками, что увеличивает продолжительность жизни экспериментальных животных;
6. Выполнено патентное исследование.
7.Проведено протеомное картирование лизатов нейральных (CD 133+) стволовых клеток (НСК), выделенных из обонятельной выстилки носа человека, мезенхимальных (CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, СD34–) стволовых клеток (МСК) человека, полученных из костного мозга человека и опухолевых (CD133+) стволовых клеток (ОСК), изолированных из культуры клеточной линии глиобластомы человека линии U87. Идентифицированы 1664 белка в изученных лизатах стволовых клеток (СК), из которых 1052 белка (63,2%) идентичны в НСК и ОСК и 607 белков (36,47%) подобны в МСК и ОСК.