Регистрация / Вход
Прислать материал

Клеточная биотехнология программирования switch фенотипа макрофагов для терапии рака

Докладчик: Малышев Игорь Юрьевич

Должность: Зав.кафедрой

Цель проекта:
1. Формулировка задачи/проблемы, на решение которой направлен реализуемый проект. Первый этап (2014 г.): Подготовительный - научный анализ и обоснование выбора направлений исследований Задача 1. Написание аналитического обзора на тему «Аномальное программирование макрофагов и лимфоцитов (Th0 и Т клеток) в основе нарушения иммунного ответа и патогенеза опухолей», для получения объективного и современного представления о состоянии проблемы, а также для обоснования наиболее оптимального варианта направления исследований, уточнения плана и методологии проведения научных исследований. Пути решения: Использование электронных библиотек научных статей, таких как PubMed и др. Поиск источников на глубину 10 лет (2004-2014 годы) Задача 2. Проведение патентного поиска, в котором будут обозначены возможные прототипы и аналоги и доказана новизна предлагаемой клеточной технологии. Пути решения: Проведение патентного поиска в соответствии с ГОСТ Р 15.011-96 и поиск сведений об охранных и иных документах, которые могут препятствовать применению результатов работ в Российской Федерации. Задача 3. Проведение экспериментальных исследований: сравнение роста экспериментальной опухоли Эрлиха и выживаемости мышей разных генетических линий с разным генетически детерминированным фенотипом макрофагов; Пути решения: В работе будут использованы мыши линии С57/BL6J и С57/BL6N, которые имеют преимущественно М1 фенотип макрофагов и BALB/c, которые имеют преимущественно М2 фенотип (Mills et al., 2000). В экспериментах будут использованы клетки асцитной карциномы Эрлиха (Эмануэль, 1977; Гвичия, 1983). Опухолевые клетки будут вводиться в брюшную полость. Рост опухоли происходит неравномерно. В кривой роста опухоли различают 3 участка: латентный период, или лаг-фаза, охватывает 1-5 дни после появления опухоли в организме; период логарифмического увеличения числа клеток, или лог-фаза, 7-12 дни; и терминальный период, за которым следует гибель организма, 13 - 16 дни (Эмануэль Н.М., 1987). Средняя продолжительность жизни мышей с опухолью Эрлиха составляет 14-18 дней после прививки опухоли. Экспериментальная опухоль Эрлиха является удобной моделью злокачественного новообразования. Она часто применяется для решения различных задач в экспериментальной онкологии. В настоящее время, кроме асцитного, известны солидные варианты опухоли Эрлиха. Однако их характеристики роста и методы перевивки описаны в литературе недостаточно. В связи с чем их использование в экспериментальной работе затруднительно. Второй этап (2014 г.): Экспериментальный – «реверсный» макрофаг: разработка способов репрограммирования и формирования обратной связи у макрофагов Задача 4. Проведение экспериментальных исследований: 1. оценка изменения фенотипа макрофагов в ходе развития экспериментальной опухоли Эрлиха; 2. оценка продукции NO и спектра цитокинов в асцитной жидкости мышей с экспериментальной опухолью Эрлиха; 3. выделение макрофагов и программирование у них «реверсного» фенотипа in vitro (первый этап разработки лабораторного прототипа клеточной биотехнологии); Пути решения: 1. оценка изменения фенотипа макрофагов в ходе развития экспериментальной опухоли Эрлиха. Макрофаги будут выделяться из перитонеальной жидкости на лаг, лог и терминальной фазе развития опухоли Эрлиха. Макрофаги будут выделяться и культивироваться по общепринятым методикам [Xia Zhang, Ricardo Goncalves, and David M. Mosser. The Isolation and Characterization of Murine Macrophages. Curr Protoc Immunol. 2008 November ; CHAPTER: Unit–14.1. doi:10.1002/0471142735.im1401s83.]. Фенотип макрофагов будет определяться по CD-маркерам, продукции оксида азота (NO) и цитокинов. CD-маркеры будут определять на проточном цитофлюориметре FC500 (Beckman Coulter, США) по инструкциям производителя. Маркерами М1 фенотипа являются CD80 и CD25, а маркерами М2 фенотипа – CD163 и CD206 [Martinez et al., 2008]. Продукция NO будет оцениваться по содержанию в среде конечных метаболитов NO – нитритов [Gordon S. 2003]. Концентрацию нитритов будут определять с помощью реактива Грисса и измерения оптической плотности при 540 нм на микропланшетном ридере (Bio Rad, США). Продукция цитокинов будет оцениваться с помощью проточной цитофлюорометрии и коммерческого набора на определение большого количества разных цитокинов. О приобретении макрофагами М1 фенотипа будет свидетельствовать увеличение, а о приобретении М2 фенотипа –снижение СD маркеров М1 фенотипа, провоспалительных цитокинов и продукции NO [Mantovani et al., 2006]. 2. оценка продукции NO и спектра цитокинов в асцитной жидкости мышей с экспериментальной опухолью Эрлиха. Оценка продукции NO и спектра цитокинов в асцитной жидкости мышей будет оцениваться методами, указанными в пункте 2. Асцитная жидкость будет отбираться на лаг, лог и терминальных фазах развития опухоли Эрлиха. 3. выделение макрофагов и программирование у них «реверсивного» фенотипа in vitro (первый этап разработки лабораторного прототипа клеточной биотехнологии). Имея ввиду ключевую проопухолевую роль аномального репрограммирования макрофагов в М2 фенотип и побочные эффекты существующих основанных на макрофагах методов, мы в этом проекте, начнем разработку клеточной биотехнологии, направленной на создание макрофага с антиопухолевым М1 фенотипом, который был бы резистентнен к программирущим факторам опухоли и который бы за счет отрицательной обратной связи, выделял бы такое количество провоспалительных антиопухолевых медиаторов, которые уже обеспечивали бы антиопухолевый эффект, но еще не инициировали побочные эффекты, указанные в таблице 2. Наш подход будет основан на биологическом принципе разветвления внутриклеточного сигнала с целью формирования отрицательной обратной связи. Например, известно, что опухоль выделяет TGF-β. Активация TGF-β рецептора на макрофаге приводит к активации фактора транскрипции Smad и продукции проопухолевых антивоспалительных цитокинов (Hanada, Yoshimura. 2002). Одновременно, хотя и в меньшей степени, TGF-β активирует фактор транскрипции AP-1 (Xiao et al. 2002), который активирует синтез провоспалительных антиопухолевых цитокинов (Eferl, 2003; Smolinska et al. 2011). Таким образом, при чрезмерном действии TGF-β может формироваться отрицательная обратная связь, которая через активацию AP-1 может ограничивать основной антивоспалительный проопухолевый эффект TGF-β. Наша идея о создании «реверсивного» фенотипа макрофага, состоит в том, что ингибирование Smad может привести к такому фенотипу макрофага, который в ответ на действие репрограммирующих проопухолевых факторов опухоли, таких как TGF-β, будет отвечать продукцией провоспалительных антиопухолевых цитокинов. В этом случае, достижение “реверсного” эффекта может произойти за счет того, что чем больше опухоль будет выделять проопухолевого TGF-β, тем больше макрофаг будет секретировать антиопухолевых провоспалительных цитокинов, и наоборот. Таким образом, продукция провоспалительных цитокинов “реверсивным” макрофагом будет происходить пропорционально действию опухолевого TGF-β. Мы ожидаем, что это 1) не только не позволит опухоли перепрограммировать макрофаг на проопухолевый М2 фенотип, но и 2) адекватно усилит провоспалительное антиопухолевое действие макрофага именно в зоне опухоли, а также 3) ограничит избыточное воспаление и повреждение тканей и 4) ограничит активацию супрессорных Treg клеток и MDSC, которые подавляют антиопухолевый иммунитет. В начале выполнения проекта будет написан аналитический обзор, в котором будут подробно оценены возможности использования разветвления внутриклеточного сигнала от всех основных, выделяемых опухолью факторов репрограммирования макрофагов на М2 фенотип, таких как IL-10, VEGF, IL-4 и других, которые будут обнаружены в асцитной жидкости мышей с опухолью Эрлиха. Исследования проведенные в 2014 году дадут важную информацию для детализации разработки нашей клеточной биотехнологии. Прототипом “реверсного” макрофага могут служить макрофаги с заблокироваными анти-воспалительными факторами транскрипции STAT3 и STAT6. По данным Sica A, Mantovani A. (2012) такие макрофаги ограничивали развитие меланомы. Блокирование STAT только частично реализует концепцию “реверсивного” макрофага, потому что сигнальные пути активирующие STAT не имеют ответвления на провоспалительные гены. Блокирование STAT приводит только к угнетению продукции антивоспалительных проопухолевых цитокинов, но не усиливает продукцию провоспалительных антиопухолевых. “Реверсивный” макрофаг, в отличие от STAT-блокированного макрофага будет иметь отрицательную обратную связь с опухолью: чем больше опухоль будет продуцировать проопухолевые цитокины, которые будут стремиться перепрограммировать макрофаг на проопухолевый М2 фенотип, тем больше «реверсивный» макрофаг будет приобретать антиопухолевый М1 фенотип и продуцировать провоспалительные антиопухолевые цитокины. Формирование/усиление отрицательной обратной связи у «реверсивного» фенотипа будет проверено в культуре клеток по оценке продуцируемых макрофагов цитокинов в ответ на действие проопухолевых цитокинов (IL-10, IL-4, TGF-β, и возможно еще другие). Будут протестированы несколько ингибиторов (например ингибиторов факторов транскрипции антивоспалительных цитокинов) с целью выбора наиболее эффективного для формирования отрицательной обратной связи. Будут изучены основные характеристики «реверсивного» макрофага, такие как секреция, фагоцитоз, миграция и с помощью метода cDNA-array описан паттерн экспрессии генов. Задача 5. Утверждение диссертационных тем молодых исследователей. Пути решения: В ходе выполнения проекта в 2014 году будет представлена к утверждению 1 диссертационная тема, связанная с исследованиями данного проекта. Задача 6. Публикация результатов научных исследований в трудах международных или всероссийских конференций и журналах. Пути решения: По результатам выполнения НИР будут опубликованы статьи в научных журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных "Сеть науки" (WEB of Science) Третий этап (2015 г.): Экспериментальный: – «реверсный» макрофаг: разработка способов введения и оценка антиопухолевого эффекта in vivo и in vitro Задача 7. Проведение экспериментальных исследований: введение репрограммированных макрофагов с «реверсивным» фенотипом в культуру опухолевых клеток Эрлиха с целью оценки терапевтического потенциала новой биотехнологии (второй этап разработки лабораторного прототипа клеточной биотехнологии). Пути решения: В ходе выполнения работ будет усовершенствована методика введения, репрограммированных in vitro макрофагов в культуру клеток опухоли Эрлиха. Снятие репрограммированных макрофагов со дна культуральной лунки будет проводиться с помощью трипсина. Введение, репрограммированных in vitro макрофагов в культуру клеток опухоли Эрлиха будет осуществляться в лаг, лог и терминальную фазу роста клеток опухоли Эрлиха в культуре с целью определения терапевтической эффективности введения макрофагов на разных стадиях развития опухоли. Терапевтическая эффективность будет оцениваться прежде всего по снижению динамики роста опухолевых клеток в культуре. Задача 8. Проведение экспериментальных исследований: обратное введение репрограммированных макрофагов с «реверсивным» фенотипом мышам с экспериментальной опухоли Эрлиха с целью оценки терапевтического потенциала новой биотехнологии (второй этап разработки лабораторного прототипа клеточной биотехнологии). Пути решения: В ходе выполнения работ будет усовершенствована методика обратного введения, репрограммированных in vitro макрофагов, мышам с опухолью Эрлиха. Снятие репрограммированных макрофагов со дна культуральной лунки будет проводиться с помощью трипсина. Обратное введение, репрограммированных in vitro макрофагов, мышам с опухолью Эрлиха будет осуществляться в лаг, лог и терминальную фазу опухоли Эрлиха с целью определения терапевтической эффективности введения макрофагов на разных стадиях развития опухоли. Терапевтическая эффективность будет оцениваться прежде всего по продолжительности жизни мышей с опухолью и по количеству опухолевых клеток в асците мышей. Лабораторный биотехнологический регламент репрограммирования макрофагов должен быть оформлен с учетом требований ОСТ 64-02-003-2002. Четвертый этап (2015 г.) Завершающий: Обобщение, анализ и распространение результатов исследований. Задача 9. Защита диссертационных тем молодых исследователей. Пути решения: В ходе выполнения проекта в 2015 году будет представлена к защите 1 диссертационная тема, связанная с исследованиями данного проекта. Задача 10. Публикация результатов научных исследований в трудах международных или всероссийских конференций и журналах. Пути решения: По результатам выполнения НИР будут опубликованы статьи в научных журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных "Сеть науки" (WEB of Science) и средствах массовой информации. Задача 11. Оценка эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем. Пути решения: В конце второго года проекта будет написан аналитический обзор с оценкой эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем в области биотехнологий лечения опухолей. Задача 12. Разработка рекомендаций и внедрение результатов НИР в образовательных процесс. Пути решения: Разработка рекомендаций по внедрению и начало внедрения результатов НИР в образовательных процесс и программу научно-образовательных курсов на кафедре патофизиологии лечебного факультета МГМСУ им. А.И. Евдокимова в форме не менее 2-х методических пособий на основании полученных результатов НИР для студентов, интернов и ординаторов медицинских Вузов в разделах «Иммунология», «Патофизиология опухолей», дополнений к элективному курсу «Клеточные биотехнологии в медицине», для интернов и ординаторов, включающего полученные результаты и дополнений к теоретическому курсу лекций в разделах «Иммунология», «Патофизиология опухолей», «Патофизиология клетки». Задача 13. Написание заключительного отчета. Масштаб задач проекта определяется тем, что они 1) находится на стыке двух важных фундаментальных областей науки и медицины: механизмы нарушения иммунного ответа при канцерогенезе и биотехнологии коррекции иммунного ответа при росте опухолей, 2) имеют отношение к поиску эффективных путей терапии онкологических заболеваний, которые занимают одно из лидирующих мест в смертности людей во всем мире и 3) могут инициировать разработку аналогичных подходов репрограммирования иммунных клеток при многих социально-значимых заболеваниях, связанных с нарушением иммунного ответа, таких как хроническая обструктивная болезнь легких, диабет, атеросклероз и др. 2. Формулировка цели реализуемого проекта; конечного продукта, создаваемого с использованием результатов, планируемых при выполнении проекта; места и роли проекта и его результатов в решении задачи/проблемы. Проект направлен на достижение 3 целей, связанных с целями Программы на развитие научно-технического комплекса страны: 1. Получение значимых научных результатов, и на этой основе проведение разработка и экспериментальное испытание принципиально новой клеточной биотехнологии ограничения роста опухоли с целью инициации нового направления в терапии рака; 2. Предоставление научно-исследовательским организациям и индустриальному партнеру результатов исследований и последующее информационное продвижение новых знаний об эффективных биотехнологиях борьбы с раком; 3. Инициирование мероприятий для вывода на рынок новой биотехнологии мирового уровня с целью снижения потерь от социально значимых заболеваний (рак), обеспечения экспортного потенциала и замещение импорта и создания конкурентных преимуществ для отечественных разработок в области этих исследований.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Краткое описание основных результатов (основные практические и экспериментальные результаты, фактические данные, обнаруженные взаимосвязи и закономерности).

Данные о том, что в регионе опухолевого роста макрофаги меняют свой фенотип с антиопухолевого М1 на проопухолевый М2, позволили нам предложить к разработке принципиально новую клеточную биотехнологию, основанную на программировании макрофагов в антиопухолевый М1 фенотип с обратной биологической связью, с целью ограничения опухолевого роста и предупреждения побочных эффектов избыточного воспаления.
Анализ литературы показывает, что идея об использовании репрограммированых на М1 фенотип макрофагов с созданной in vitro обратной связью (на действие факторов опухоли) для ограничения опухолевого роста еще не высказывалась. При успешном завершении проекта результаты, несомненно, будут обладать всеми признаками новизны. Перспективность использования новой технологии, в случае успешной разработки, будет гарантирована тем, что она направлена на коррекцию ключевого звена нарушенного антиопухолевого иммунного ответа и будет препятствовать развитию побочных эффектов избыточного воспаления. Предлагаемые фундаментальные исследования по трансформации фенотипа макрофагов и разработке новой клеточной биотехнологии полностью обеспечат достижение заявленной цели проекта.
Ожидаемыми результатами ПНИ будут:
Результаты анализов и теоретических изысканий.
- В 2014 году будет представлен аналитический обзор на тему «Аномальное программирование макрофагов и лимфоцитов (Th0 и Т клеток) в основе нарушения иммунного ответа и патогенеза опухолей», в котором будет дано объективное и современное представление о состоянии проблемы, а также обоснованы наиболее оптимальные варианты исследований и методологии разработки новой биотехнологии.
- В 2015 году будут представлен аналитический обзор с оценкой эффективности полученных результатов проекта в сравнении с современным научно-техническим уровнем в области биотехнологий лечения опухолей.
- Будут представлены к защите 1 диссертационная работа и опубликованы 5 статей в журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных "Сеть науки" (WEB of Science) с индексом цитирования не ниже 1.
- Будет начато внедрение результатов НИР в образовательных процесс на кафедре патофизиологии лечебного факультета МГМСУ им. А.И. Евдокимова. Будут 1) разработаны не менее 2-х методических пособий на основании полученных результатов НИР для студентов, интернов и ординаторов медицинских Вузов в разделах «Иммунология», «Патофизиология опухолей» и 2) разработаны дополнения к элективному курсу «Клеточные биотехнологии в медицине», для интернов и ординаторов, включающего полученные результаты; 3) внедрены полученные результаты в образовательный процесс в виде дополнений к теоретическому курсу лекций в разделах «Иммунология», «Патофизиология опухолей», «Патофизиология клетки».
- Для доведения до потребителя ожидаемых научных и научно-технических результатов проекта дополнительно будут использованы несколько эффективных путей и действий, таких как публикация статей в российских медицинских газетах; представление результатов на биотехнологическом и/или медицинском форумах, конференциях и выставках, подготовка видеосюжетов для средств массовой информации в интернете и на ТВ.
Результаты патентных исследований. Результаты патентного поиска дадут возможность обозначить возможные прототипы и аналоги и доказать новизну предлагаемой клеточной технологии.
Научные результаты.
- Будет охарактеризовано изменение секреторного фенотипа перитонеальных макрофагов по мере развития опухоли Эрлиха,
- Будут охарактеризованы генетические особенности изменения фенотипа макрофагов при развитии опухоли Эрлиха и выживаемость мышей разных генетических линий с разным фенотипом макрофагов,
- Будет охарактеризован цитокиновый и NO паттерн асцитной жидкости по мере развития опухоли Эрлиха,
- Будет определена группа внутриклеточных сигнальных механизмов макрофагов (включая факторы транскрипции), запускаемых цитокинами опухоли, переключение, которых репрограммирует макрофаг на «реверсивный» фенотип, со способностью отвечать на проопухолевые цитокины увеличением продукции антиопухолевых медиаторов.
- На экспериментальной опухоли карциномы Эрлиха будет оценена антиопухолевая эффективность макрофагов с «реверсивным» фенотипом.

2. Основные характеристики планируемых результатов (в целом и/или отдельных элементов), планируемой научной (научно-технической, инновационной) продукции.

Протоколы и лабораторные регламенты прототипа новой клеточной биотехнологии с «пошаговым» описанием всей процедуры программирования «реверсивного» фенотипа макрофагов и его использования. Регламент экспериментов будет удовлетворять следующим основным характеристикам:
• На этапе выделения макрофагов объем собираемой перитонеальной жидкости должен быть не менее 10 мл, а параметры выживаемости макрофагов не ниже 95%;
• На этапе культивирования макрофагов параметры продолжительности жизни макрофагов в условиях культуры клеток должны быть не менее 5 дней с выживаемостью к 5 дню не ниже 90%; соотношение количество макрофагов/площадь культивирования/объем культуральной среды - 1 млн/1 см2/1 мл;
• Процедура оценки фенотипа макрофагов будет удовлетворять следующим требованиям:
фенотип должен оцениваться по не менее, чем трем показателям: секреторная активность (продукция про- и анти-воспалительных цитокинов и NO), наличие поверхностно-клеточные CD маркеров М1 и М2 фенотипа и форма клеток (круглая, характерная для М1 фенотипа и распластанная – для М2);
• Точность определения всех параметров должна быть не ниже точности указанной в инструкциях производителей наборов реактивов, китов и приборов.
Результаты должны быть получены в экспериментах с соблюдением правил GLP.
В мире наибольшее увеличение продолжительности жизни мышей с экспериментальной опухолью было получено при использовании аденовирус-модифицированных макрофагов с гиперпродукцией IL-12. Продолжительность жизни в этом случае увеличивалась на 24-42%% (Reay et al. 2009, Nasu et al. 1999). Результаты полученные в предыдущем гранте ФЦП (который заявители успешно завершили) показали, что простой М1 фенотип без обратной реверсивной связи может обеспечить увеличение продолжительности жизни минимум на 50%. Мы ожидаем, что «реверсивный» макрофаг с обратной связью может увеличить продолжительность жизни более чем на 70% или даже обеспечить выживание.

3. Оценка элементов новизны научных (технологических) решений, применявшихся методик и решений.
Научная новизна определяется:
Во-первых, постановкой принципиально новой инновационной научно-исследовательской задачей – изучить внутриклеточные сигнальные пути переключения фенотипа макрофага и на этой основе разработать клеточную биотехнологию получения иммунных клеток с реверсным фенотипов и эффективным антиопухолевым действием. Впервые на основе изучения механизмов репрограммирования макрофагов будет исследована возможность блокирования ключевого механизма канцерогенеза – трансформации антиопухолевой активности иммунитета в проопухолевую.
Во-вторых, впервые будут определены: 1. внутриклеточные сигнальные пути, переключение, которых может реверсировать проопухолевый сигнал (антивоспалительные цитокины IL-10, IL-4, TGF-b, выделяемые опухолью) в продукцию макрофагами антиопухолевых медиаторов (провоспалительные цитокины IL-12, IFN-g, TNF-a и оксид азота), 2. конкретные факторы транскрипции в этих сигнальных каскадах, блокирование которых приведет к переключению проопухолевого сигнала от опухоли в антиопухолевый ответ макрофагов и 3. эффективность предлагаемой биотехнологии на культуре опухолевых клеток и на модели экспериментальной асцитной карциномы Эрлиха. Перспективность нового подхода, в случае успешной разработки, будет гарантирована тем, что она направлена на коррекцию ключевого звена нарушенного антиопухолевого иммунного ответа.
В-третьих, высокой возможностью получения результатов, способных к правовой охране.


4. Сопоставление с результатами аналогичных работ, определяющими мировой уровень.
Сравнительная характеристика уровня научно-исследовательского потенциала в проблеме подавления роста опухолей с помощью технологий направленных на макрофаги в других странах с примерами решения указанной проблемы. В нескольких научных центрах мира уже проводятся исследования по оценке макрофагов в качестве терапевтических мишеней (Chie Kohch et al. 2004; Yue ZQ et al. 2012; Allavena P, Mantovani A. 2012). К основным научным конкурентам в мире по заявляемой в проекте теме относятся исследователи из США, Японии и стран Западной Европы. Научные коллективы этих ученых и их публикации представлены ниже:
Aharinejad S, et al. Colony-stimulating factor-1 antisense treatment suppresses growth of human tumor xenografts in mice. Cancer Res 2002; 62: 5317-5324.
Allavena P, Mantovani A. Immunology in the clinic review series; focus on cancer: tumour-associated macrophages: undisputed stars of the inflammatory microenvironment. Clin Exp Immunol. 2012;167(2):195-205.
Andrews K et. al. Adenovirus-interleukin-12-mediated tumor regression in a murine hepatocellular carcinoma model is not dependent on CD1-restricted natural killer T cells. Cancer Res. 2000 Nov 15;60(22):6457-64.
Baay M, Brouwer A, Pauwels P, Peeters M, Lardon F. Tumor cells and tumor-associated macrophages: secreted proteins as potential targets for therapy. Clin Dev Immunol. 2011;2011:565187
Banciu M e.a. Antiangiogenic effects of liposomal prednisolone phosphate on B16 melanoma in mice. J Control Release 2006; 113: 1-8
Burke e.a. Macrophages in gene therapy: cellular delivery vehicles and targets. J Leukoc Biol 2002;72: 417-28.
Chie Kohchi et al. Utilization of Macrophages in Anticancer Therapy: The Macrophage Network Theory. Anticancer Research 24: 3311-3320 (2004)
Dalerba e.a. Reconstitution of telomerase reverse transcriptase expression rescues colorectal carcinoma cells from senescence: evidence against immortality as a constitutive trait of tumor cells. Cancer Res 2005;65: 2321-9.
Eferl R, Wagner EF. AP-1: a double-edged sword in tumorigenesis. Nat Rev Cancer 2003;3(11):859-68
Hanada T, Yoshimura A. Regulation of cytokine signaling and inflammation. Cytokine Growth Factor Rev 2002;13(4-5):413-21
Gazzaniga S, Bravo AI, Guglielmotti A et al. Targeting tumor-associated macrophages and inhibition of CCL2 reduce angiogenesis and tumor growth in a human melanoma xenograft. J Invest Dermatol 2007; 127: 2031-2041.
Kohchi C, Inagawa H, Hino M et al. Utilization of macrophages in anticancer therapy: the macrophage network theory. Anticancer Res 2004;24(5C):3311-20
Lewēn S, Zhou H, Hu H. et al. Legumain-based minigene vaccine targets the tumor stroma and suppresses breast cancer growth and angiogenesis. Cancer Immunol Immunother 2008; 57: 507-515.
von Marschall Z et al. Effects of interferon alpha on vascular endothelial growth factor gene transcription and tumor angiogenesis. J Natl Cancer 2003; 95: 437-448.
Nasu Y et al. Adenovirus-mediated interleukin-12 gene therapy for prostate cancer: suppression of orthotopic tumor growth and pre-established lung metastases in an orthotopic model. Gene Ther. 1999 Mar;6(3):338-49.
Ostrand-Rosenberg S, Sinha P. Myeloid-derived suppressor cells: linking inflammation and cancer. J Immunol 2009;182(8):4499-506
Pàez-Ribes M, Allen E, Hudock J, Takeda T, Okuyama H, Viñals F, et al. Antiangiogenic therapy elicits malignant progression of tumors to increased local invasion and distant metastasis. Cancer Cell 2009; 15: 220-231.
Peng J, Tsang JY, Li D et. al. Inhibition of TGF-β signaling in combination with TLR7 ligation re-programs a tumoricidal phenotype in tumor-associated macrophages. Cancer Lett. 2013 May 1;331(2):239-49.
Pittet M., Mempel T. Regulation of T-cell migration and effector functions: insights from in vivo imaging studies. Immunol Rev 2008;221:107-129
Reay J, Kim SH, Lockhart E, Kolls J, Robbins PD. Adenoviral-mediated, intratumor gene transfer of interleukin 23 induces a therapeutic antitumor response. Cancer Gene Ther. 2009 Oct;16(10):776-85
Rey-Giraud F, Hafner M, Ries CH. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 2012;7(8):e42656.
Robinson S e.a. A Chemokine receptor antagonist inhibits breast tumor growth. Cancer Res 2003;63(23):8360-5
Rolny C, Mazzone M, Tugues S. et al. HRG inhibits tumor growth and metastasis by inducing macrophage polarization and vessel normalization through downregulation of PlGF. Cancer Cell 2011; 19: 31-44.
Satoh T, Saika T, Ebara S, Kusaka N, Timme TL, Yang G, Wang J, Mouraviev V, Cao G, Fattah el MA, Thompson TC. Macrophages transduced with an adenoviral vector expressing interleukin 12 suppress tumor growth and metastasis in a preclinical metastatic prostate cancer model. Cancer Res 2003;63(22):7853-60
Sessa C, De Braud F, Perotti A, Bauer J, Curigliano G, Noberasco C, et al. Trabectedin for women with ovarian carcinoma after treatment with platinum and taxanes fails. J Clin Oncol 2005; 23: 1867-1874.
Sica A, Mantovani A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J Clin Invest 2012;122(3):787-95
Smolinska M et. al. Hck tyrosine kinase regulates TLR4-induced TNF and IL-6 production via AP-1. J Immunol 2011;187(11):6043-51
Takano S, Aramaki Y, Tsuchiya S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharm Res 2003; 20: 962-968.
Tiemessen M, Jagger A, Evans H, van Herwijnen MJ, John S, Taams LS. CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells induce alternative activation of human monocytes/ macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104(49):19446-51
Xiao YQ, Malcolm K, Worthen GS, Gardai S, Schiemann WP, Fadok VA, Bratton DL, Henson PM. Cross-talk between ERK and p38 MAPK mediates selective suppression of pro-inflammatory cytokines by transforming growth factor-beta. J Biol Chem 2002;277(17):14884-93
Yue ZQ, Liu YP, Ruan JS, Zhou L, Lu Y. Tumor-associated macrophages: a novel potential target for cancer treatment. Chin Med J (Engl). 2012 Sep;125(18):3305-11
Используется несколько подходов, направленных на макрофаги в зоне опухоли (Tumor-Associated Macrophages, ТАМ): 1) истощение ТАМ, 2) перепрограммирование М2 фенотипа ТАМ на антиопухолевый М1 фенотип; 3) блокирование рецепторов, через которые опухоль перепрограммирует ТАМ на М2 фенотип; 4) селективное усиление антиопухолевых свойств ТАМ; 5) селективное угнетение проопухолевых свойств ТАМ и 6) блокирование секреторных продуктов ТАМ.
Даже беглый обзор существующих, основанных на макрофагах биотехнологий подавления опухоли, позволяет увидеть, что многие из них основаны либо на «хирургическом» принципе: удалении проопухолевых макрофагов, блокировании рецепторов или секреторных продуктов, либо на «стимулирующем»: стимулирование отдельных антиопухолевых функций или стимулирование формирования М1 фенотипа у макрофагов в зоне опухоль.
Все существующие подходы до какой-то степени препятствуют росту опухоли, но как правило, временно (Baay M et al. 2011). Например, на разных мышинных моделях опухолей исследователям при введение аденовируса с гиперпродукцией провоспалительного цитокина IL-12, удавалось увеличить среднюю продолжительность жизни мышей только на 24-42%% (Reay et al. 2009, Nasu et al. 1999). Причина в том, что ни один из них не затрагивает фундаментальной основы макрофагального звена канцерогенеза – опухоль-индуцированного аномального перепрограммирования макрофагов на проопухолевый фенотип и не учитывает побочных отдаленных проопухолевых эффектов, существующих антиопухолевых подходов. Например, перепрограммирование макрофагов на провоспалительный М1 фенотип или стимулирование провоспалительных функций макрофагов с помощью введения генов IFN-γ или IL-12 (таблица 1) первоначально может замедлить рост опухоли, за счет усиления продукции провоспалительных цитокинов. Однако эти же цитокины могут повреждать соседние здоровые ткани и самое главное активировать Treg клетки и Myeloid-Derived Suppressor Cells (MDSC) (Ostrand-Rosenberg and Sinha. 2009). Дальше активированные Treg клетки и MDSC могут подавить антиопухолевую активность не только М1 макрофагов, но и антигенпрезентирующих клеток, Th1 и T клеток (Ostrand-Rosenberg and Sinha. 2009; Tiemessen et al. 2007; Pittet et al., Mempel T. 2008).
Таким образом антиопухолевый эффект М1 макрофагов, через активацию Treg клеток и MDSC может трансформироваться в проопухолевые последствия. Становиться понятным, что недостаточная эффективность существующих подходов связана с постоянным перепрограммирующим действием опухоли на макрофаги и другие иммунные клетки, отсутствием обратной связи между модифицированным макрофагом и опухолью и побочными проопухолевыми эффектами антиопухолевого действия макрофагов.

5. Пути и способы достижения заявленных результатов, ограничения и риски. Пути решения представлены в задачах проекта.


Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Описание областей применения планируемых результатов (области науки и техники; отрасли промышленности и социальной сферы, в которых могут использоваться или планируемая на их основе инновационная продукция);

Области применения ожидаемых результатов.
1. Оценка практического применения результатов работы (где, при каких условиях будут применимы результаты работ, широта и масштабность их применения), в том числе с учетом межотраслевой направленности применения;
- Научная и научно-техническая продукция ПНИ проекта может найти широкое применение в области клеточных биотехнологий, иммунологии, медицине и образовательном процессе медицинских вузов. Продукция НИР может быть востребована научно-исследовательскими учреждениями, биотехнологическими и инвестиционными компаниями. Пока трудно полностью оценить значение нового подхода для терапии опухолей. Возможно этот подход сможет эффективно дополнить химиотерапию или лучевую терапию, а в некоторых случаях использоваться как основное лечение. Для того, чтобы полностью оценить возможность практического применения результатов ПНИ проекта, необходимы дальнейшие разработки клинической версии новой биотехнологии. Данные полученные в проекте, протоколы и регламенты, несомненно могут быть применимы для обоснования и разработки клинического варианта биотехнологии терапии рака. Представление о возможной широте и масштабности применения эффективных противоопухолевых технологий (основанных на прототипе разработанном в проекте), дает тот факт, что проблема опухолей затрагивает здоровье более 40% процентов мужчин и женщин. Кроме того, межотраслевая направленной применения новых эффективных подходов терапии рака определяется тем, что эта проблема опухолей выходит за рамки здравоохранения и имеет колоссальные негативные экономические и социальные последствия.
- Принципиально новая биотехнология с модификациями может быть использована не только для лечения опухолей, но в перспективе также для лечения других заболеваний с нарушенным иммунным ответом, таких как диабет, сердечно-сосудистые заболевания, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера и другие. При успешном завершение проекта его результаты могут инициировать разработку модификаций для использования биотехнологии при широком круге заболеваний с нарушенным иммунным ответом.

2. Описание практического внедрения планируемых результатов или перспектив их использования;

Способы использования ожидаемых результатов.
Перспективность вновь создаваемой интеллектуальной собственности в части патентоспособности будущих результатов исследований и их лицензионных возможностей. Коммерциализация результатов работ станет, несомненно, возможной в случае удачного завершения проекта и оформления патентов в области биотехнологий и медицины. Результаты работ могут представлять коммерческий интерес для биотехнологических и инвестиционных компаний. В рамках данных ПНИ будет сделан первый необходимый шаг к коммерциализации результатов – проведение патентного поиска, разработка лабораторного прототипа и работа по оформлению патента на новую клеточную биотехнологию.
Ожидаемые результаты могут быть использованы в образовательном процессе. Будут 1) разработаны не менее 2-х методических пособий на основании полученных результатов НИР для студентов, интернов и ординаторов медицинских Вузов в разделах «Иммунология», «Патофизиология опухолей» и 2) разработаны дополнения к элективному курсу «Клеточные биотехнологии в медицине», для интернов и ординаторов, включающего полученные результаты; 3) внедрены полученные результаты в образовательный процесс в виде дополнений к теоретическому курсу лекций в разделах «Иммунология», «Патофизиология опухолей», «Патофизиология клетки».


3. Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие научно-технических и технологических направлений; разработка новых технических решений; на изменение структуры производства и потребления товаров и услуг в соответствующих секторах рынка и социальной сфере. Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие исследований в рамках международного сотрудничества, развитие системы демонстрации и популяризации науки, обеспечении развития материально-технической и информационной инфраструктуры.

Прогнозная характеристика конкурентных преимуществ вероятных результатов работы, а также эффекта от их применения.
При использовании аденовирус-модифицированных макрофагов с гиперпродукцией IL-12 продолжительность жизни мышей со злокачественной опухолью увеличивалась на 24-42%% (Reay et al. 2009, Nasu et al. 1999). «Реверсивный» макрофаг с обратной связью может увеличить продолжительность жизни более чем на 70% или даже обеспечить выживание. К конкурентным преимуществам ожидаемый новой технологии относится 1) отсутствие при ее использовании проблем иммунного отторжения, так как будут использоваться собственные клетки организма и 2) отсутствие побочных эффектов репрограммирования «реверсного» фенотипа макрофагов, так как эта процедура будет проводиться in vitro и самое главное, 3)отсутствие проопухолевого репрограммирования макрофагов и всего иммунного ответа. Эти преимущества будут способствовать улучшению потребительских свойств клеточных биотехнологий в терапии рака.

Научная и научно-техническая продукция НИР может быть применима в области клеточных биотехнологий, иммунологии, медицине (онкологии) и образовательном процессе медицинских вузов. Продукция НИР может быть востребована в НИИ, биотехнологическими и инвестиционными компаниями, и вузами. Индустриальный партнер, как потребитель
Ожидаемые результаты будут соответствовать конкретным потребностям индустриального партнера, а именно получение аналитического обзора современного состояния проблемы использования клеточных биотехнологий в онкологии, a также информационное продвижение современных биотехнологических продуктов, включая результаты, полученные в проекте, в средствах массовой информации с целью вывода на рынок новой биотехнологии мирового уровня для снижения потерь от социально значимых заболеваний (рак), обеспечения экспортного потенциала и замещение импорта в отечественном здравоохранении и создания конкурентных преимуществ для отечественных разработок в области этих исследований.

Для доведения до потребителя ожидаемых научных и научно-технических результатов проекта будут использованы несколько эффективных путей и действий:
- публикация статей в научных российских и зарубежных специализированных журналах,
- публикация статей в российских медицинских газетах;
- представление результатов на биотехнологических и медицинских форумах, конференциях и выставках,
- подготовка видеосюжетов для средств массовой информации в интернете и на ТВ.
- прямое информирование индустриального партнера

Текущие результаты проекта:
По пункту 1.1. ПГ: Продолжено написание аналитического обзора современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ.
По пункту 1.2. ПГ: Продолжен подбор условий программировании фенотипа макрофагов и факторов транскрипции и сигнальных путей, модулирование активности которых, будет приводить к формированию «реверсного» антиопухолевого фенотипа макрофага, способного усиливать продукцию антиопухолевых факторов пропорционально действию проопухолевых факторов опухоли.
По пункту 1.4. ПГ: Продолжены исследования роли NO в антиопухолевом действии макрофагов и формировании антиопухолевого М1 фенотипа.
По пункту 1.5. ПГ: Продолжены патентные исследования.

По пункту 1.6. ПГ: Продолжен сбор материала для аналитического обзора.
По пункту 1.7. ПГ: Продолжены работы по материально-техническому обеспечению работ.
По пункту 1.8. ПГ: Начато выполнение работ по достижению показателей результативности проекта.
По пункту 1.9. ПГ: Продолжены работы по модернизация лаборатории (электроснабжение, системы вентиляции, очистки и кондиционирования воздуха и др.) для обеспечения условий по культивированию клеток.

За отчетный период полученны следующие результаты:

По пункту ПГ «1.1. Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ.» по анализу литературы завершается написание аналитического обзора по плану:
1. ИММУННЫЕ КЛЕТКИ И ИХ РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ ПРИ ИММУННОМ ОТВЕТЕ
1.1. СИГНАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ МАКРОФАГОВ
1.2. ЭПИГЕНЕТЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ МАКРОФАГОВ
1.3. ПОСТТРАНСКРИПЦИОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ МАКРОФАГОВ
1.4. МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ МАКРОФАГОВ
2. РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ ИММУННЫХ КЛЕТОК ПРИ РАЗВИТИИ ОПУХОЛЕЙ
2.1. РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ ИММУННЫХ КЛЕТОК, ИНИЦИИРОВАННОЕ М1 МАКРОФАГАМИ ЛЕЖИТ В ОСНОВЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ЗАЩИТЫ
2. 2. АНОМАЛЬНОЕ МАТРИЧНОЕ РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ ИММУННЫХ КЛЕТОК В ОСНОВЕ ПАТОГЕНЕЗА ОПУХОЛЕЙ

По пункту ПГ «1.2. Подбор условий программировании фенотипа макрофагов и факторов транскрипции и сигнальных путей, модулирование активности которых, будет приводить к формированию «реверсного» антиопухолевого фенотипа макрофага, способного усиливать продукцию антиопухолевых факторов пропорционально действию проопухолевых факторов опухоли.» по анализу литературы завершается обоснование подбора условий для формирования реверсного фенотипа по плану:
1. СУЩЕСТВУЮЩИЕ ТЕХНОЛОГИИ МАКРОФАГ-ОРИЕНТИРОВАННОЙ ТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ И ИХ НЕДОСТАТКИ
2. ОБОСНОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПРОГРАММИРОВАНИЯ «РЕВЕРСНОГО» АНТИОПУХОЛЕВОГО ФЕНОТИПА МАКРОФАГА
3. АСЦИТНАЯ КАРЦИНОМА ЭРЛИХА

По пункту «1.8. Выполнение работ по достижению показателей результативности проекта» начаты работы по достижению показателя «Количество мероприятий по демонстрации и популяризации результатов и достижений науки, в которых приняла участие и представила результаты проекта организация”. Концепция реверсного фенотипа макрофагов, которая может лечь в основу создания противоопухолевой биотехнологии представлена на международном научном форуме на The 3rd International Conference and Exhibition on Clinical and Cellular Immunology, Immunology Summit-2014, J Clin Cell Immunol Volume 5, Issue 5 , Pages 88, http://dx.doi.org/10.4172/2155-9899.S1.017, ISSN: 2155-9899 (September 29-October 01, 2014, Baltimore, USA), IF-3,146 (http://omicsonline.org/clinical-cellular-immunology.php).

2) оценка элементов новизны научных, конструкторских и технологических решений, информацию о полученных на отчетном этапе охраноспособных РИД;
Ожидается, что новизна научных, конструкторских и технологических решений предлагаемых в проекте будет высокой и будет подтверждена результатами патентного поиска, которые будут представлены в конце 2014 г

3) оценка соответствия полученных результатов техническим требованиям к выполняемому проекту и перспектив продолжения работ по проекту.
Ожидается, что получаемые результаты будут соответствовать техническим требованиям к проекту и обеспечат хорошие перспективы для успешного выполнения работ.