Регистрация / Вход
Прислать материал

Биомиметика ангидробиоза: разработка новых подходов в хранении биоматериалов медицинского и сельскохозяйственного назначения

Докладчик: Шагимарданова Елена Ильясовна

Должность: Старший научный сотрудник, кандидат биологических наук

Цель проекта:
Проект направлен на решение проблемы энергозависимости хранения биологического материала, включая ткани, клетки и белки от низких температур. Проект реализуется на основе знаний о структуре генома и механизмах работы генов ангидробиотического (способного выживать без воды) насекомого. Будут созданы генетические конструкции обеспечивающие экспрессию целевых белков в уникальной клеточной линии, устойчивой к полному обезвоживанию с последующим сохранением свойств целевых белков и повышения устойчивости клеток высших организмов к значительной потере воды, включая полное обезвоживание.

Основные планируемые результаты проекта:
Основной целью проекта является создание научно-технического задела для создания новой технологии хранения живых клеток и тканей при комнатной температуре в сухом состоянии. В частности будут созданы генетических конструкций для экспрессии чужеродных белков в единственной на сегодняшний момент клеточной культуре Pv11 способной к выживанию без воды, и разработка протокола их длительного хранения в сухом состоянии без потери биологических функций. Кроме того, генетические конструкции будут оптимизированы для использования в клетках млекопитающих, для безопасного синтеза криопротекторов и защитных белков непосредственно в клетках. Разработка данной методики позволит значительно увеличить безопасность и стабильность сохранения клеточного материала медицинского и сельскохозяйственного назначения (например ооцитов), а также создать предпосылки для получения способов хранения клеток млекопитающих без воды без потери жизнеспособности.

Задачами комплекса исследований является создания научно-технического задела для разработки и применения протоколов значительного повышения устойчивости клеток (и клеточных культур) высших организмов (включая человека) к абиотическим стрессам, в первую очередь к обезвоживанию. Главными целями исследований должны являться данные, которые позволят: разработать методики сохранения жизнеспособности клеток и тканей при полном обезвоживании и эффективно замещать токсичные консерванты типа DMSO используемые для криохранения клеток на нетоксичные соединения типа дисахаридов (трегалоза и пр.) В качестве подходов к решению поставленных задач предлагается доказавшая в последние годы свою эффективность стратегия биомиметики: использование биомолекул, являющихся основой ангидробиоза (выживания при полном обезвоживании) в ряде организмов способных эффективно противостоять потерям воды. В качестве методологических лабораторных подходов к решению поставленных задач предлагается ряд методов по:
1. Получению набора "выживания чувствительных к потере воды белков": cоздание генетических конструкций несущих чувствительные к обезвоживанию регуляторные участки контролирующие экспрессию целевых генов и их синтез продуктов этих генов в уникальных клетках Pv11 устойчивых к полному обезвоживанию. Синтез целевых белков, таким образом, будет инициироваться обезвоживанием и целевые белки будут храниться в сухом виде без потери жизнеспособности.
2. На втором этапе будет осуществлена экзогенная экспрессия полученных плазмид с генами кодирующие ферменты синтеза трегалозы и стресс-белки вовлеченные в процесс ангидробиоза в клетках млекопитающих для усовершенствования методов долгосрочного их хранения как в
условиях заморозки, так и в условиях обезвоживания. При реализации проекта планируется активное использование современных методов молекулярной и клеточной биологии.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Получение эффективных способов безводного хранения белков биологическая активность которых теряется при классической лиофилизации является безусловно ожидаемым и востребованным в современной медицине и биотехнологии. Так, методика получения, безводного хранения и быстрого выделения активных белков будет востребованна в диагностических системах медицинского назначения. Кроме того, методология найдет свое активное применение в мероприятиях по созданию био-банков , так как позволит многократно снизить затраты на хранение биологического материала, а в ряде случаев практически полностью исключить зависимость хранения важных белков от низких температурных
энергозатратных систем. Протоколы синтеза защитных белков и трегалозы в ооцитах млекопитающих будут, без сомнений, широко востребованны в сельском хозяйстве и особенно в области сохранения генетического материла ценных пород домашних животных. Так, например, авторы проекта ожидают значительного прогресса в области хранения ооцитов, исключающего необходимость во внешних генотоксичных консервантах, что явится
одним из важных шагов в создании более безопасных и энергосберегающих подходов в хранении биоматериала животноводческого назначения.

Полученные генетические конструкции и методики будут востребованны в первую биотехнологическими компаниями производящими диагностические системы на основе активных белков, а также фармацевтическими предприятиями. Методики повышения безопасности и эффективноти хранения клеток млекопитающих, и, особенно, в животноводстве, послужат основой для оптимизации технологии хранения клеточного материала в соответствующих профильных биобанках регионального и федерального значения.

В ходе реализации проекта планируется участие в ряде международных и региональных конференций в области биологии и сельского хозяйства. В 2015 и 2016 годах планируется активное участие в российско-японских инвестиционных форумах. Запланировано и согласовано участие коллектива в ряде мероприятий фонда Сколково. На сайте лаборатории курирующей проект будет создана информационная страница о ходе реализации проекта.

Текущие результаты проекта:
1. Изучение патентных баз на данном этапе свидетельствует что тематика научно-прикладного проекта обладает высоким патентным потенциалом. Так, нами не были обнаружены защищенные патентами методологические решения хранения биомате-риалов в основе которых лежит пассивное обезвоживание без привлечения сложной приборной базы. Кроме того, нами не были выявлены генетические конструкции, созданные на основе геномных данных нерастительных организмов, синтез белков в которых можно было бы инициировать в клетках животных обезвоживанием.
2. На данном этапе, обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы по теме безводного и низкотемпературного хранения клеток пока-зывает, что одним из ключевых нерешенных вопросов в этой области является про-блема доставки крио-консервантов в клетки. Cуществует значительная потребность в разработке и опробации методов, позволяющих осуществлять безопасную доставку, либо синтез нетоксичных (!) консервантов в клетки животных, включая ооциты.
3. Использование дополнительных баз данных прочтений генома хирономиды и созда-ние гибридных “сборок” генома с применением комбинации ПО (SPAdes, СLC и Platanus) позволило на данном этапе оптимизировать сборку генома так, что теперь минимальная длина фрагмента генома составляющая вместе с другими самыми длинными фрагментами более 50% длины генома (значение N50) было увеличено на 30%, что позволяет получать более детальные данные о структурной композиции ге-нов. Использование в качестве матрицы обновленной сборки, позволило выявить более 50 генов, ранее отсутствующих в базе данных MidgeBase.
4. На данном этапе японскими партнерами выделены две основные линии клеток Pv11 (Pv11-shi и Pv11-o) обладающие наибольшей устойчивостью к полному обезвожива-нию в присутствии трегалозы. Проведен анализ имеющихся в литературе и соб-ственных данных по известным геномным регионам чувствительности к обезвожи-ванию в растениях. Предварительный анализ показывает, что сходных по генетиче-ской последоваельности регионов в геноме хирономиды не наблюдается. Таким образом, результаты свидетельствуют о том, что животные устойчивые к полному обезвоживанию обладают уникальными геномными последовательностями несущими регуляторные участки контролирующие работу генов в условиях потери воды.

В конце октября 2014 года на базе КФУ был проведен российско-японский семинар "Life of Genomes" направленный на координацию работы российско-японской группы, популяризацию знаний об устойчивости организмов к обезвоживанию и информирование академической среды о первых результатах работы над проектом.