Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка диагностического набора, основанного на принципе конкурентного иммуноферментного анализа, для определения уровня аутоантител к β1-адренорецептору у больных с идиопатическими нарушениями ритма и проводимости сердца и при наличии сердечно-сосудистой патологии

Докладчик: Власик Татьяна Николаевна

Должность: Руководитель лаборатории клеточной инженерии ИЭК ФГБУ "РКНПК" Минздрава России, к.б.н.

Цель проекта:
1. Формулировка задачи/проблемы, на решение которой направлен реализуемый проект. Несмотря на достижения в течение последних лет в области диагностики и лечения нарушений ритма сердца, раннее установление диагноза и определение тактики лечебных мероприятий в зависимости от патогенетических механизмов развития желудочковых нарушений ритма сердца остается по-прежнему cерьезной клинической и социальной проблемой. Выявление желудочковых нарушений ритма сердца является серьезным поводом для тщательного обследования с применением комплекса дорогостоящих методов диагностики. Однако установить причину желудочковых нарушений ритма сердца зачастую довольно сложно, в связи с чем патогенетически обоснованная терапия не назначается, а проводится паллиативное лечение, что ведет к прогрессированию заболевания и, следовательно, ранней инвалидизации молодых пациентов трудоспособного возраста. Одной из актуальных проблем современной аритмологии является исследование воспалительного поражения миокарда аутоиммунного и инфекционного генеза как патогенетической основы развития и поддержания нарушений ритма сердца. Диагностика изменений в иммунной системе является важным инструментом, позволяющим своевременно назначать комплексные лечебно-профилактические мероприятия, предупреждающие развитие нарушений ритма и первичных заболеваний миокарда. Особенно актуальна проблема мониторинга аутоантител к β1-адренорецептору. Несмотря на множество попыток, до сих пор в мире не удалось создать доступных коммерческих наборов для подобного диагностикума. 2. Формулировка цели реализуемого проекта; конечного продукта, создаваемого с использованием результатов, планируемых при выполнении проекта; места и роли проекта и его результатов в решении задачи/проблемы. Формулировки даются в краткой форме, научно-популярным языком. Для решения вышеописанной проблемы в рамках реализуемого проекта поставлены следующие цели: 1). Создать лабораторный прототип диагностического набора, основанный на принципе конкурентного иммуноферментного анализа. 2). Разработать метод определения аутоантител к β1-адренорецептору для диагностики аутоиммунных изменений у больных с идиопатическими нарушениями ритма и проводимости сердца и при наличии сердечно-сосудистой патологии. 3). Определить уровень аутоантител к β1-адренорецептору у больных с идиопатическими нарушениями ритма и проводимости сердца и при наличии сердечно-сосудистой патологии.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Краткое описание основных результатов (основные практические и экспериментальные результаты, фактические данные, обнаруженные взаимосвязи и закономерности).

1) Будет создан лабораторный прототип диагностического набора для определения уровня аутоантител к β1-адренорецептору в крови пациентов методом конкурентного ИФА с использованием экспрессирующих рекомбинантный β1 адренорецептор иммобилизованных клеток в качестве твердофазного носителя антигена в его природной конформации.
2) Будет разработана методика определения уровня аутоантител к β1 адренорецептору в образцах плазмы или сыворотки крови и составлен проект инструкции по применению диагностического набора.
3) Будут получены результаты изучения эффективности лабораторного прототипа диагностического набора для диагностики аутоиммунных изменений у больных с идиопатическими нарушениями ритма и проводимости сердца и при наличии сердечно-сосудистой патологии.
4) Будет установлен характер связи между наличием аутоантител к β1 адренорецептору и развитием определенных сердечно-сосудистых патологий.

2. Основные характеристики планируемых результатов (в целом и/или отдельных элементов), планируемой научной (научно-технической, инновационной) продукции.

1) Прототип диагностического набора будет сконструирован для анализа не менее 10 образцов на одном планшете. Набор предназначен только для диагностики in vitro. В состав диагностического набора войдут:
а) иммуносорбент: 96-луночный планшет для ИФА с иммобилизованными клетками, экспрессирующими рекомбинантный β1-адренорецептор человека;
б) препарат с фиксированной концентрацией мышиных моноклональных антител, специфических ко второй внеклеточной петле β1-адренорецептора;
в) система иммуноферментного выявления сорбированных мышиных иммуноглобулинов;
г) отрицательная контрольная проба плазмы крови человека, не содержащая аутоантител к β1-адренорецептору человека;
д) положительная контрольная проба плазмы крови человека, содержащая антитела к β1-адренорецептору человека.
Уровень аутоантител в образце плазмы или сыворотки крови будет определяться по степени конкуренции с мышиным моноклональным антителом за связывание с клетками-носителями антигена.
2) Клетки млекопитающих, трансфицированные плазмидной конструкцией с геном β1-адренорецептора человека, будут экспрессировать на своей поверхности в среднем не менее 5000 молекул рекомбинантного β1-адренорецептора на клетку.
3) Клетки-продуценты мышиного моноклонального антитела к β1 адренорецептору будут производить и секретировать не менее 10 мкг антитела в расчете на 1 миллион клеток за 24 ч.
4) В процессе выполнения анализа будет смываться не более 20% иммобилизованных клеток.
5) Время подготовки к работе будет составлять не более 1 часа, а общее время проведения анализа – не более 30 часов.

3. Оценка элементов новизны научных (технологических) решений, применявшихся методик и решений.

Аналоги предлагаемой разработки – коммерчески доступные диагностические наборы для определения аутоантител к β1-адренорецептору методом конкурентного ИФА с использованием в качестве твердофазного носителя антигена клеток млекопитающих, трансфицированных рекомбинантным геном β1 адренорецептора человека, – в настоящее время отсутствуют.

4. Сопоставление с результатами аналогичных работ, определяющими мировой уровень.

Предлагаемый диагностический набор основан на принципе конкурентного иммуноферментного анализа "третьего поколения", считающегося золотым стандартом для определения аутоантител к поверхностным белкам клеток человека. Характерным преимуществом конкурентного ИФА являются более высокие показатели диагностической специфичности и чувствительности по сравнению со стандартным методом пептидного ИФА. В настоящее время в мире существует единственный коммерчески доступный набор подобного рода, служащий для определения аутоантител к рецептору тиреотропного гормона. Несколькими группами ученых активно разрабатываются подходы к созданию диагностических наборов для определения аутоантител-агонистов к β1 адренорецептору как методом конкурентного ИФА третьего поколения, так и путем совершенствования ИФА на основе пептидных антигенов.

5. Пути и способы достижения заявленных результатов, ограничения и риски.

Для достижения заявленных результатов планируется следующее.
1) Провести оптимизацию и синтезировать гены тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела, специфического к природной конформации второй внеклеточной петли β1-адренорецептора человека.
2) Сконструировать эффективный двухкассетный вектор и встроить в него синтезированные гены.
3) Провести трансфекцию клеток млекопитающих и получить стабильную клеточную линию, способную производить рекомбинантное моноклональное антитело к β1 адренорецептору.
4) Синтезировать оптимизированный ген β1-адренорецептора человека, провести трансфекцию клеток, исходно не имеющих β1-адренорецептора, и получить стабильную линию клеток, экспрессирующих на своей поверхности рекомбинантный β1-адренорецептор. Возможным ограничением здесь является негативное влияние избыточного количества адренорецепторов на жизнедеятельность клеток.
5) Разработать метод радиолигандного анализа для определения представленности β1-адренорецептора на поверхности клеток млекопитающих, при помощи данного метода продемонстрировать эффективность и стабильность экспрессии β1 адренорецептора в полученной линии клеток.
6) Разработать метод иммобилизации клеток млекопитающих на планшете для ИФА. Иммобилизация клеток должна быть достаточно надежной, чтобы обеспечить возможность проведения всех процедур анализа и воспроизводимость результатов.
7) Подобрать параметры, отработать условия и составить протокол лабораторного метода определения аутоантител с использованием экспрессирующих β1 адренорецептор иммобилизованных клеток в качестве твердофазного иммуносорбента, а в качестве конкурентных антител – рекомбинантных мышиных моноклональных антител к β1-адренорецептору. Возможные низкие титры аутоантител к адренорецептору вызывают необходимость использования малых концентраций моноклональных антител-конкурентов, что может потребовать значительного увеличения времени реакции. Кроме того, не исключено, что с данными моноклональными антителами будет способна конкурировать лишь определенная фракция аутоантител-агонистов.
8) Провести отбор и клиническое обследование групп больных с идиопатическими нарушениями ритма и проводимости сердца и при наличии сердечно-сосудистой патологии, сформировать банк биообразцов обследованных больных и соответствующую базу данных.
9) Провести измерения уровня аутоантител к β1-адренорецептору в собранных биообразцах при помощи разработанного прототипа диагностического набора и методом стандартного ИФА с использованием пептидных фрагментов β1 адренорецептора, проанализировать и сравнить полученные результаты.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Описание областей применения планируемых результатов (области науки и техники; отрасли промышленности и социальной сферы, в которых могут использоваться или планируемая на их основе инновационная продукция):

Планируемые результаты исследования позволят создать диагностический набор, который в будущем сможет быть использован в специализированных медицинских учреждениях для определения аутоиммунных изменений у больных с нарушениями ритма и проводимости сердца.

2. Описание практического внедрения планируемых результатов или перспектив их использования

В рамках исследования будут проведены лабораторные испытания созданного прототипа диагностического набора на коллекции биообразцов, полученных от больных с нарушениями ритма и проводимости сердца. Результаты будут сопоставлены с особенностями анамнеза, клинического течения, показателями хронотропной функции сердца, данными инструментального обследования (в том числе с данными МРТ сердца с гадолинием), а также выраженностью и характером проявлений желудочковой эктопической активности у данных категорий больных, что позволит установить диагностическую и прогностическую ценность данного иммунологического показателя для клинической аритмологии. В перспективе созданный диагностический набор позволит проводить раннее выявление аутоиммунных изменений у данных категорий больных. Подтверждение роли аутоиммунных механизмов в развитии нарушений ритма сердца и других сердечно-сосудистых патологий у определенных категорий больных может стать обоснованием применения терапевтической иммунокоррекции (иммуносорбция аутоантител, иммуномодулирующая терапия) как составной части противоаритмического лечения и позволит оценивать эффективность лечения у конкретного больного.

3. Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие научно-технических и технологических направлений; разработка новых технических решений.
1) Разработка твердофазного ИФА с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка человека, экспрессированного на поверхности иммобилизованных клеток, окажет существенное влияние на развитие нового поколения диагностикумов для определения аутоантител за счет использования антигенных детерминант, максимально приближенных по своим свойствам к нативным, что позволит принципиально увеличить специфичность определения аутоантител.
2) Высокоэффективный двухкассетный плазмидный вектор, содержащий ряд дополнительных функциональных элементов, можно будет использовать в технологии производства других рекомбинантных моноклональных антител диагностичнского или терапевтического назначения.

Текущие результаты проекта:
1) Составлен аналитический обзор информационных источников. Обзор включает: формулировку и обоснование клинических задач исследования; описание принципа конкурентного иммуноферментного анализа; рассмотрение основных технологий получения ключевых компонентов разрабатываемого набора - рекомбинантных моноклональных антител и клеток, экспрессирующих рекомбинантный антиген; характеристику метода радиолигандного анализа для измерения уровня экспрессии β1-адренорецептора.
2) Проведены патентные исследования по ГОСТ 15.011-96.
3) Осуществлен дизайн плазмидных конструкций для экспрессии гена β1 адренорецептора и генов тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела к β1-адренорецептору в клетках млекопитающих.
4) Составлен протокол клинического обследования 5 групп пациентов: 40 больных с нарушениями ритма без признаков органического поражения сердца, 40 больных с нарушениями ритма и ишемической болезнью сердца, 40 больных с дилатационной кардиомиопатией воспалительного генеза и 2 группы сравнения: 15 больных с ишемической болезнью сердца без нарушений ритма и 15 здоровых добровольцев. Протокол включает следующие инструментальные методы обследования: 12-канальное холтеровское мониторирование ЭКГ;
панорамное поверхностное картирование сердца; эхокардиографию (ЭХОКГ); рентгенографию органов грудной клетки; МРТ сердца с контрастированием.
5) Разработана структура базы данных для хранения и анализа результатов клинического, инструментального и лабораторного обследования пациентов.
6) Проведено комплексное клинико-инструментальное и лабораторное обследование 52 пациентов, начато формирование банка биообразцов.