Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка конъюгированных вакцин на основе синтетических углеводных лигандов против возбудителей госпитальных инфекций

Докладчик: Симбирцев Андрей Семенович

Должность: Директор, профессор, докт. мед. наук

Цель проекта:
Целью прикладного научного исследования является разработка конъюгированных вакцинных препаратов на основе рекомбинантного белка-носителя CRM197 и синтетических спейсерированных углеводных лигандов, структурно родственных альгинату бактерии Pseudomonas aeruginosa и общему полисахаридному антигену клеточной стенки патогенных грибов – прототипов вакцин для лечения госпитальных бактериальных и грибковых инфекций. В настоящее время отсутствуют эффективные средства лечения ряда социально значимых бактериальных и грибковых заболеваний. В случае некоторых бактериальных патогенов, плесневых грибов и дрожжей целесообразность и актуальность разработки вакцин диктуется их возрастающей резистентностью к действию антибиотиков. Действие имеющихся в настоящее время вакцин против перечисленных типов патогенов во многих случаях основано на индуцировании иммунного ответа против полисахаридных антигенов, представленных на клеточной стенке патогена. В качестве примеров таких вакцин можно указать гемофильную (педиатрическая вакцина против Haemophilus influenza типа b), пневмококковую вакцину (олиговалентная вакцина против ряда серотипов Streptococcus pneumoniae) и целый ряд других, являющихся ключевыми составляющими вакцинопрофилактики населения в мире. Однако многие вакцинные продукты, критически важные для отечественного здравоохранения, в России не производятся и представлены только импортными препаратами, которые к тому же не вполне отвечают современным требованиям и нуждаются в модификации. Результаты работы будут использованы для проведения доклинического исследования разработанных вакцинных препаратов и разработки технологии производства конъюгированных вакцин.

Основные планируемые результаты проекта:
В ходе выполнения ПНИ будут получены следующие результаты: методика синтеза β-(1→4)-олигоманнуронозидов; методика синтеза β-(1→3)-олигоглюкозидов, включающих 3, 5 и 7 моносахаридных звеньев; методика синтеза β-(1→3)-олигоглюкозидов, включающих 9, 11 и 13 моносахаридных звеньев; методика очистки рекомбинантного белка CRM197; методика рефолдинга рекомбинантного белка CRM197 в процессе очистки; методика конъюгирования белка-носителя CRM197 с синтетическими олигосахаридными лигандами; лабораторный регламент получения конъюгированных вакцин на основе синтетических олигосахаридных лигандов и белка-носителя CRM197; экспериментальные образцы конъюгированной вакцины против P. aeruginosa на основе белка-носителя CRM197 и синтетических олигосахаридных лигандов различной длины – фрагментов бактериального альгината; экспериментальные образцы конъюгированной вакцины против грибов Candida и Aspergillus на основе белка-носителя CRM197 и синтетических олигосахаридных лигандов - фрагментов поверхностных углеводных антигенов патогенных грибов; методика синтеза покрывающих антигенов для оценки эффективности и специфичности иммунного ответа с использованием иммуноферментного анализа (ИФА).
Экспериментальные образцы конъюгированной вакцины против P. aeruginosa и грибов Candida и Aspergillus будут соответствовать следующим требованиям:
− содержать в среднем не менее 4-х углеводных лигандов на молекулу белка по данным масс-спектрометрии MALDI-TOF;
− индуцировать образование IgG антител, специфичных фрагментам бактериального альгината или грибкового β-(1→3)-глюкана, в экспериментах на животных;
− титр специфических IgG антител в иммунных сыворотках должен не менее чем в 2 раза превышать титр антител в сыворотках неиммунизированных животных;
− опсонизирующая активность иммунных сывороток должна превышать активность сывороток неиммунизированных животных не менее чем на 15%.
Существующие в настоящее время углеводные вакцины имеют в своей основе специфические углеводные структуры, как правило, олигосахариды, локализованные на клеточной поверхности патогенов. Технология получения вакцин на основе нативных полисахаридов имеет ряд недостатков, связанных с трудностями культивирования бактерий и выделения, очистки и стандартизации полисахаридов. Получение конъюгированных вакцин с использованием синтетических фрагментов полисахаридов строго определенного строения лишено перечисленных недостатков.
Вариант дифтерийного токсина CRM197 используется в составе вакцины против пневмонии Prevenar (Wyeth Whitehall Export GmbH, США) в количестве 20 мкг на одну иммунизирующую дозу. Предлагаемая для освоения генно-инженерная технология получения CRM197 имеет ряд преимуществ по сравнению с существующей технологией, основанной на культивировании штамма Corynebacterium diphtheriae линии С7 с последующим выделением дифтерийного токсина, а именно: позволяет получать за одно культивирование в ферментере объемом 50 л до 2 000 000 доз адъюванта за один производственный цикл (7 дней); исключает непосредственную работу с дифтерийным патогеном; имеет более низкий класс опасности на производстве; получаемый препарат имеет высокую степень очистки и меньшую аллергенность, лучшую переносимость при введении, меньшую себестоимость.
В результате проекта будут созданы экспериментальные образцы вакцины против P. aeruginosa, а также вакцины против грибковых патогенов Candida и Aspergillus. Конъюгированные вакцины на основе синтетических олигосахаридных фрагментов строго определенного строения обладают высокой специфичностью и способны индуцировать более сильный иммунный ответ, чем соответствующие вакцинные препараты на основе полисахаридов, выделенных из микроорганизмов. Конъюгированные вакцины на основе синтетических углеводных лигандов строго определенного строения позволят более эффективно бороться с бактериальными и грибковыми инфекциями.
Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, будут отвечать мировому уровню исследований в области разработки конъюгированных вакцинных препаратов на основе синтетических углеводных лигандов.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Результаты проекта предполагается использовать для доклинического исследования вакцинных препаратов и разработки технологии производства конъюгированных вакцин. По результатам доклинических исследований будут отобраны кандидаты конъюгированных вакцин для последующих клинических исследований.
Разрабатываемые конъюгированные вакцинные препараты могут быть использованы для организации производства и медицинского применения на территории Российской Федерации. За счет снижения стоимости препарата в сравнении с зарубежными аналогами ожидается улучшение лекарственного обеспечения, повышение качества оказания медицинской помощи и улучшение результатов лечения больных бактериальными и грибковыми госпитальными инфекционными заболеваниями, а также повышение качества их жизни.
Кроме того, разработка метода получения белка-носителя CRM197 имеет экономические выгоды, связанные с освоением новых технологий, созданием новых рабочих мест и импортозамещением.

Текущие результаты проекта:
Выполнен аналитический обзор научных информационных источников, содержащих данные о белке CRM197, показано, что в последнее время сильно возрастает интерес к CRM197 и его потенциальной противоопухолевой активности, обусловленной способностью связывать растворенный HB-EGF, который очень высоко экспрессируется в различных человеческих опухолях. В результате подготовки обзора по синтезу бета-(1→3)-олигоглюкозидов выбраны оптимальные структуры гликозил-акцептора (1), начиная с которого происходит удлинение олигосахаридной цепи, и гликозил-донора (2), с помощью которого это удлинение осуществляется, определен оптимальный набор O- и N-защитных групп в 1 и 2, уходящей группы в 2 и структуры гликозилируемой группировки.
Проведены патентные исследования в соответствии с ГОСТ Р 15.011-96 с использованием информационно-поисковых ресурсов, баз данных патентных документов национальных, региональных и международных патентных организаций. Заявляемая тема охраноспособна.
Исследована сегрегационная и структурная стабильность плазмидных ДНК pС197 в штамме E.coli - продуценте белка CRM197. Структурная стабильность оценена с помощью метода секвенирования по Сенджеру всей полноразмерной плазмидной ДНК (5200 пар нуклеотидов) в периоды 20, 40, 80 и 160 генераций (моделирования процессов культивирования и хранения в банке штамма-продуцента).
Изучены культуральные особенности штамма-продуцента белка CRM197.
Проведена оптимизация культивирования штамма-продуцента белка CRM197 в ферментерах объемом 10, 20 и 50 литров, оценен уровень экспрессии белка, определены параметры необходимые для максимальной продуктивности.
Разработан метод синтеза спейсерированного бета-(1→3)-триглюкозида и гликозил-акцептора на его основе для получения более длинных олигомеров, включающих нечетное количество (3, 5, 7 и.т.д.) моносахаридных звеньев.