Регистрация / Вход
Прислать материал

Получение нуклеиновых кислот с помощью трифосфатов дезоксинуклеозидов, содержащих низкомолекулярные функциональные группы на пиримидиновых основаниях.

Докладчик: Чудинов Александр Васильевич

Должность: Старший научный сотрудник

Цель проекта:
Разработать методы получения ПЦР-амплифицируемых фрагментов ДНК, содержащих на гетероциклических основаниях низкомолекулярные функциональные группы, включая фрагменты аминокислот, входящих в антигенсвязывающие центры иммуноглобулинов, для создания технологических основ направленного синтеза ДНК-аптамеров, способных специфично взаимодействовать с биологическими мишенями различной природы, включая молекулы белков и нуклеиновых кислот.

Основные планируемые результаты проекта:
Разработка методов получения фрагментов модифицированных ДНК, способных нарабатываться в ходе ПЦР является сложной задачей, требующей комплексного подхода для успешного решения. Сложность задачи обусловлена рядом факторов, включая необходимость многостадийного органического синтеза и учета влияния структурных ограничений, влияющих на субстратные свойства трифосфатов нуклеозидов.
Предлагаемое нашим коллективом решение поставленной задачи основано на комплексном подходе, включающем (А) синтез модифицированных 2′-дезоксинуклеозидтрифосфатов, (Б) выявление роли структурных факторов, (В) детальную характеристику полноты включения модифицированных трифосфатов, (Г) определение специфичности связывания модифицированных ДНК фрагментов с комплементарной последовательностью ДНК. Универсальность предлагаемого подхода позволит осуществить разработку трифосфатов 2′-дезоксинуклеозидов, содержащих низкомолекулярные функциональные группы на пиримидиновых основаниях.
В качестве базовых структур для разработки нами предлагаются пиримидиновые нуклеотиды, несущие на гетероциклических основаниях низкомолекулярные функциональные группы присоединенные по С5 положению аллильными (на основе этилена), пропаргильными (на основе ацетилена) или амидными (на основе карбониламида) линкерами, разработка структур которых явится одной из основных задач ПНИ.
Оценка степени включения в ДНК модифицированных нуклеозидтрифосфатов будет проведена с использованием процедуры достраивания праймера (primer extension) с оценкой эффективности и специфичности ДНК-полимераз и вновь синтезированных модифицированных нуклезидтрифосфатов. Будут использованы некоторые из традиционных методов анализа, таких как гель-электрофорез, масс-спектрометрия, ферментативный гидролиз или рестрикционный анализ, ПЦР в реальном времени, а также предложены новые подходы с использованием анализа на олигонуклеотидных микрочипах и секвенирования природных ампликонов с модифицированных матриц.
В результате выполнения проекта будут разработаны методы синтеза и получена серия препаратов дезоксиуридинтрифосфатов и дезоксицитидинтрифосфатов, несущих на пиримидиновых основаниях низкомолекулярные функциональные группы, включая фрагменты аминокислот, входящих в антигенсвязывающие центры иммуноглобулинов, в частности - фрагменты лейцина, фенилаланина, изолейцина, валина, гистидина и триптофана.
На основе синтезированных препаратов модифицированных дезоксиуридинтрифосфатов и дезоксицитидинтрифосфатов будут разработаны методы получения ПЦР-амплифицируемых фрагментов ДНК, содержащих на гетероциклических основаниях низкомолекулярные функциональные группы, включая фрагменты аминокислот, входящих в антигенсвязывающие центры иммуноглобулинов.
Будет изучено влияние химической природы линкера и типа ДНК-полимеразы на эффективность получения модифицированных фрагментов нуклеиновых кислот, содержащих функциональные группы на пиримидиновых основаниях.
Выполнение цикла запланированных работ явится необходимым этапом создания технологических основ направленного синтеза модифицированных ДНК-аптамеров (сомамеров), с целью разработки высокотехнологичного производства препаратов, способных специфично взаимодействовать с биологическими мишенями различной природы, включая молекулы белков и нуклеиновых кислот.
Полученные результаты будут способны к правовой защите в РФ и за рубежом (подача заявки по процедуре PCT) и последующей коммерциализации индустриальным партнером по лицензионному соглашению






Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Потребителями научной продукции, полученной в результате выполнения предлагаемого проекта, будут индустриальный партнер ООО «Биочип ИМБ» и Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН.
ООО «Биочип ИМБ» планирует лицензировать и довести до практического применения новый метод введения в трифосфаты нуклеозидов как низкомолекулярных функциональных групп для создания производства и последующего распространения соединений этого класа заинтересованным организациям, проводящим работы по созданию модифицированных ДНК-аптамеров (сомамеров), с целью разработки высокотехнологичного производства препаратов, обладающих высокой специфичностью связывания с биологическими мишенями различной природы, включая молекулы белков и нуклеиновых кислот.
Одним из возможных потребителей дезоксинуклеозидтрифосфатов, предназначенных для конструироваия аптамеров, может стать Государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН (планируемый соисполнитель работ по проекту), в котором ведутся исследования принципов конструирования и селекции аптамеров. Дальнейшее продвижение научной продукции данного проекта будет связано с характеристиками получаемых аптамеров.
Положительные результаты ПНИ в части применения новых дезоксинуклеозидтрифосфатов, содержащих низкомолекулярные функциональные группы на пиримидиновых основаниях, потребуют в дальнейшем разработки технологии их масштабного получения, аттестации и сертификации в соответствии с законодательством РФ. Эта работа будет выполняться индустриальным партнером ООО БИОЧИП-ИМБ, подписавшим соответствующее соглашение и заинтересованным в будущем производстве и распространении трифосфатов 2’-дезоксинуклеозидов, содержащих низкомолекулярные функциональные группы на пиримидиновых основаниях. Эти соединения будут производиться в России впервые, и в их использовании будут заинтересованы организации, занимающиеся разработкой модифицированных ДНК-аптамеров (сомамеров) с целью создания высокотехнологичного производства препаратов, способных специфично взаимодействовать с биологическими мишенями различной природы, включая молекулы белков и нуклеиновых кислот.

Текущие результаты проекта:
Работы, выполненные (выполняемые) за счет средств субсидии
Выполнили аналитический обзор литературных источников по методам получения модифицированных нуклеиновых кислот с помощью трифосфатов дезоксинуклеозидов, содержащих функциональные группы на гетероциклических основаниях проработано более 15 научно-информационных источников за период 2009 – 2013 гг. Анализировали влияние химической природы функциональных групп на пиримидиновых основаниях трифосфатов дезоксинуклеозидов и природы ДНК-полимераз на эффективность включения модифицированных нуклеотидов в нуклеиновые кислоты с помощью ДНК-полимераз. Эффективность включения модифицированных нуклеотидов зависит от субстратной специфичности используемой ДНК-полимеразы. Наиболее эффективны ДНК-полимеразы без экзо-нуклеазной активности. Анализировали методы химического синтеза трифосфатов дезоксинуклеозидов модифицированных по С5-положению пиримидиновых оснований, через алкеновый (этиленовый), алкиновый (ацетиленовый) и карбоксамидный (пептидный) линкер, которые наиболее эффективны для получения модифицированных нуклеиновых кислот с функциональными группами.
Провели патентные исследования. Поиск патентов при проведении патентных исследований осуществляли по бесплатным базам данных: http://www.espacenet.com сайт Европейской патентной организации патентных документов , международных заявок по процедуре PCT; http://www.uspto.gov сайт Соединенных штатов Америки по поиску полнотекстовых патентов с 1976 года; http://www.fips.ru сайт России с патентами и изобретениями России в банке данных Федерального института промышленной собственности; http://www.viniti.msk.su международный центр научной и технической информации (МЦНТИ) с доступом к нескольким базам данных. Найдено более 15 международных патентов имеющих отношение к тематике проекта. Данные обработаны. Отчет о патентном поиске подготовлен.
Для получения фрагментов ДНК с модифицированными нуклеотидам наиболее перспективны структуры соединений дезоксиуридинтрифосфатов с бензильной изобутильной и индольной функциональной группой, связанной по С5-положению с гетероциклическим основанием через алкеновый (этиленовый), алкиновый (ацетиленовый) и карбоксамидный (пептидный) линкер. Соединения ориентированы на получение аптамеров к значимым белковым мишеням, заменяющим по некоторым свойствам антитела. Бензильная, изобутильная и индольная группы являются фрагментами аминокислот лейцина, фенилаланина и триптофана, входят в антигенсвязывающие центры иммуноглобулинов, и в значительной мере определяют специфичность связывания антител с антигенами.
Для синтеза трифосфатов с бензильной группой связанной по С5-положению с гетероциклическим основанием через алкеновый (этиленовый) линкер выбрали 2 схемы. Первая включает многостадийное получение 5-аминоаллил-2`-дезокси-5`-трифосфатуридина и его ацилирование по аминогруппе фенилуксуснойи кислотой. Вторая схема основана на реакции аллиламида фенилуксусной кислоты с 5-иод-2`-дезоксиуридином в условиях металлокомплексного катализа по методу Хека, и последующим фосфорилированием по 5`-положению.
Для получения трифосфатов с бензильной группой связанной по С5-положению с гетероциклическим основанием через алкиновый (ацетиленовый) линкер использовать реакцию пропаргиламида фенилуксусной кислоты с 5-иод-2`-дезоксиуридином в условиях металлокомплексного катализа по методу Соногашира, и последующим фосфорилированием по 5`-положению.
Для синтеза трифосфатов с бензильной группой связанной по С5-положению с гетероциклическим основанием через карбоксамидной (пептидный) линкер также выбрали 2 схемы. По первой схеме из 5-трифторметил-2`-дезоксиуридина после защиты 5`-гидроксильной группы, получаем 5-карбокси-2`-дезоксиуридин. После защиты по 3`и по 5`-гидроксильных групп по С5-положению реакцией с бензиламином получаем карбоксамидное производное. Затем из него в несколько стадий получаем 5-бензиламинокарбонил-2`-дезокси-5`-трифосфатуридин. Эта схема пригодна для получения аналогичного карбоксамидного производного с изобутиламином. Вторая схема также многостадийна, в основе ее лежит реакция 5-иод-2`-дезоксиуридина с защищенными по 3`и 5`-гидроксильными групп с бензиламином и газообразной окисью углерода под давлением в условиях металлокомплексного катализа с получением карбоксамидного производного по С5-положению, и последующим фосфорилированием по 5`-положению. Окончательный выбор схем синтеза будет определяться экспериментальным путем.
Составили спецификации и закупили отечественные и импортные реагенты, необходимых для выполнения работ по проекту.
Выполнили синтез 2(двух) экспериментальных образцов трифосфатов дезоксинуклеозидов с бензильной и индольной группой связанной по С5-положению с гетероциклическим основанием через алкеновый (этиленовый) линкер. Многостадийным синтезом получили 5-аминоаллил-2`-дезокси-5`-трифосфатуридина и связали его по аминогруппе с фенилуксусной и индолуксусной кислотой.
Работы, выполненные (выполняемые) за счет внебюджетных средств
Провели хроматографическую очистки двух дезоксинуклеозидтрифосфатов с функциональными группами на гетероциклических основаниях и полупродуктов, используемых при их синтезе. Провели масс-спектрометрический контроль двух дезоксинуклеозидтрифосфатов с функциональными группами на гетероциклических основаниях и полупродуктов, используемых при их синтезе.
Провели подготовку к лабораторным испытаниям 2 (двух) экспериментальных образцов трифосфатов дезоксинуклеозидов с низкомолекулярными функциональными группами на гетероциклических основаниях в качестве реагентов ПЦР.Проверили работоспособность необходимого оборудования.
Провели химическую очистку растворителей и исходных реагентов, используемых при синтезе двух трифосфатов дезоксинуклеозидов с функциональными группами на гетероциклических основаниях.
Охраноспособных РИД не получено.
Полученные результаты соответствую техническим требованиям выполняемого проекта. Работа по проекту должна быть продолжена.