Регистрация / Вход
Прислать материал

Создание рекомбинантного штамма-продуцента новой MD-эндонуклеазы из энтеробактерий для использования в эпигенетике и онкодиагностике

Докладчик: Чернухин Валерий Алексеевич

Должность: старший научный сотрудник ООО "СибЭнзайм", кандидат сельскохозяйсвенных наук

Цель проекта:
1. Данный проект направлен на сохранение приоритетных позиций компании ООО "СибЭнзайм" на мировом быстрорастущем рынке производства и продаж MD-эндонуклеаз. 2. Цель проекта: создание рекомбинантного штамма-продуцента новой MD-эндонуклеазы с помощью клонирования гена фермента из энтеробактерии. Конечными продуктами являются рекомбинантный штамм-продуцента и препарат метилзависимой ДНК-эндонуклеазы, выделенный из него. Результатом проекта является пополнение ферментной базы для эпигенетики и онкодиагностики.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Результатами выполнения проекта являются новые методические подходы к поиску и клонированию MD-эндонуклеаз, будет показана приемлемость используемых биоинформационных подходов к выявлению генов новых ферментов. При анализе структуры гена MD-эндонуклеазы будут оценена консервативность его структуры, возможности поиска его гомологов среди разных таксонов бактерий.
Результатом проекта является также рекомбинантный штамм-продуцент новой MD-эндонуклеазы и препарат фермента, выделенный из него.
2. Методические подходы к поиску гомологов генов MD-эндонуклеаз позволит создавать штаммы-продуценты новых MD-эндонуклеаз и сохранить уже существующие приоритетные позиции на быстро растущем рынке ферментов данного класса
3. Метод ПЦР-скрининга для поиска новых ферментов применяется впервые для ферментов данного класса.
4. В последние 5 лет в компании "New England Biolabs" (США) и других компаниях были клонированы и описаны гены 7 новых прототипов МD-эндонуклеаз, расщепляющие последовательности ДНК с 5-метилцитозином (http://rebase.neb.com/cgi-bin/azlist?md2):
MspJI, узнающий и расщепляющий последовательность 5mCNNRNNNNNNNNN ;
LpnI, и ему подобные, узнающие и расщепляющие последовательность C5mCDGNNNNNNNNNN ;
FspEI и ему подобные, узнающие и расщепляющие последовательность C5mCNNNNNNNNNNNN ;
SgeI, узнающий и расщепляющий последовательность 5mCNNGNNNNNNNNN ;
AspBHI, узнающий и расщепляющий последовательность YS5mCNSNNNNNNNN ;
SgrTI, узнающий и расщепляющий последовательность C5mCDSNNNNNNNNNN
Vpa2008ORF185P, узнающий и расщепляющий последовательность C5mCWGG.

Конкурентным преимуществом нового фермента является его высокая активность: в отличие от указанных выше ферментов, полученный в ходе выполнения ПНИ новый фермент позволяет расщеплять ДНК с высокой эффективностью, то есть на 100%. Указанные же выше ферменты, расщепляют препараты плазмидных, фаговых и геномных ДНК, как правило, не полностью, что существенно ограничивает их применение.
Другое важное свойство, делающее результаты ПНИ конкурентноспособными на мировом рынке: новый фермент обладает новой специфичностью. По предварительным рузультатам, он узнаёт C5-метилированную четырёхнуклеотидную последовательноть 5'-GCNGC-3'. Ген фермента с такой специфичностью клонирован впервые.
5. Результаты работы достигаются путём поиска новых генов MD-эндонуклеаз в геномных ДНК индивидуальных штаммов энтеробактерий. При этом из поиска новых ферментов выпадают некультивиуемые штаммы, поэтому в перспективе необходима модернизация предложенного методического подхода с целью адаптировать его на поиск новых генов уже на образцах суммарных ДНК, взятых из природных источников.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Областями применения результатов ПНИ являются молекулярная биология, биотехнология, эпигенетика и онкодиагностика.
2. Препарат нового фермента найдёт применение в молекулярной биологии как инструмент для осуществления сайт-специфического гидролиза, а также будет использоваться в эпигеномных исследованиях и разработках тест-систем для онкодиагностики.
Результаты проекта планируется использовать в биоинформатике: полученные данные позволят аннотировать ряд нуклеотидных и аминокислотных последовательностей в существующих базах данных.
3. Результаты проекта предоставят возможность массового получения новых рекомбинантных штаммов-продуцентов MD-эндонуклез из природных источников. В перспективе поиск новых ферментов оказывается возможным не только на геномах культивируемых штаммов, но и потенциально на всех штаммах бактерий, большинство из которых (не менее 99%) не культивируется.
Возможно сотрудничество с биотехнологическими и медицинскими компаниями в сфере эпигенетики и онкодиагностики.

Текущие результаты проекта:
1. Было получено и помещено на музейное хранение 97 отдельных колоний энтеробактерий из природных источников.
2. Проведённый ПЦР-скрининг показал, что для более, чем половины клонов амплифицируются фрагменты длиной 470-1200 п.н. Были препаративно амплифицированы три разных фрагмента, которые затем встраивались в полилинкер плазмиды pUC19. В результате были наработаны препараты трёх рекомбинантных плазмид – pEsp9, pEsp17 и pEsp18.
3. Анализ полученных трёх трансформантов E. сoli показал, что только в одном случае (для плазмиды pEsp17) в трансформантах тестируется MD-эндонуклеазная активность. Целевой фермент в данном штамме получил рабочее название Esp17.
4. Были проведены экспериментальные исследования по оптимизации наработки биомассы рекомбинантного штамма-продуцента Esp17, на основе которых был разработан метод наработки биомассы. С помощью этого метода был создан экспериментальный образец – биомасса рекомбинантного штамма-продуцента Esp17.
5. Полученные три экспериментальных образца - препарат рекомбинантной плазмиды, биомасса штамма-продуцента и препарат фермента, выделенный из неё - удовлетворяют требованиям предварительно разработанных Программ и методик исследовательских испытаний.
6. Тестирование лизата целевого штамма-продуцента показало, что новая MD-эндонуклеаза расщепляет CG-метилированные ДНК фагов λ и Т7, что говорит о том, что новый фермент может быть использован для эпигенетического анализа геномной ДНК человека, которая метилирована по этим же динуклеотидам.
7. Проведённая оптимизация условий работы фермента позволила осуществить первичный анализ его сайт-специфичности. Было показано, что не смотря на то, что Esp17 является гомологом MteI, его сайт-специфичность существенно отличается. Сайт-специфичность Esp17 требует дальнейших экспериментальных исследований с целью уточнения, что будет сделано на следующих этапах выполнения данного ПНИ.