Регистрация / Вход
Прислать материал

Создание полифункционального биологического препарата для обеспечения сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы L-лизином in situ и технологии его производства

Докладчик: Фисинин Владимир Иванович

Должность: Первый вице-президент Россельхозакадемии, Директор

Цель проекта:
Целью настоящей работы является разработка биопрепарата на основе пробиотического штамма молочнокислого микроорганизма, синтезирующего L-лизин в организме сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы, и создать технологию его производства. Основные источники белка для сельскохозяйственных животных – корма растительного происхождения. Но кормовые белки, как таковые, перестают существовать уже на стадии пищеварения. Во всех дальнейших биохимических процессах участвуют продукты их ферментативного расщепления, в основном аминокислоты. Неудовлетворительные условия хранения, заготовки, переработки, тепловой обработки кормов, наличие в них плотных полисахаридных оболочек, низкая растворимость в желудочно-кишечном тракте и недостаточная доступность для пищеварительных ферментов, различная скорость всасывания и транспорта в ткани, а также антагонизм между аминокислотами, существенно снижают их эффективность. Полностью реализовать генотип моногастричных животных и птицы можно только при кормлении их кормами, сбалансированными по всем питательным и биологически активным веществам и, в частности, по лизину. Для стимулирования роста животных и птицы в птицеводстве и свиноводстве используются добавки на основе синтетического L-лизина. Большинство производств находятся в Китае, Корее, США. В настоящее время синтетическая аминокислота L-лизин, применяемая в сельском хозяйстве в Российской Федерации, производится всего лишь на одном предприятии в Белгородской области. Одна из острейших проблем российского животноводства – высокие расходы на корма, которые составляют на сегодняшний день 70-75% в структуре издержек животноводческих хозяйств. По данным ФГУП «Госниигенетика» в стране происходит рост потребления незаменимой аминокислоты лизина на 15% ежегодно. По состоянию за 2012 год, в Россию было импортировано не менее 50 000 т лизина стоимостью порядка 3-х долларов за кг. Лизин является обязательным компонентом рационов свиней и птицы, дефицит лизина приводит к падению продуктивности животных. Рост курса доллара приводит к повышению стоимости лизина, и, соответственно, снижает рентабельность отечественных сельхозпредприятий. Также в промышленном производстве свиного и куриного мяса также остро стоит проблема сохранности животных по причине легочных и кишечных заболеваний. Возможное решение проблемы –применение кормовой добавки на основе штамма молочнокислой бактерии Lactobacillus plantarum - продуцента лизина и биологически активных веществ, подавляющих условно-патогенную и патогенную микрофлору, и позволяющих проводить эффективную профилактику заболеваний за счет повышения резистентности организма. Необходимо отметить, что реализация проекта будет способствовать решению ряда отраслевых проблем: - увеличение издержек животноводческих хозяйств на корма и ветеринарные препараты при выращивании высокопродуктивных сельскохозяйственных животных; - рост потребления лизина и пробиотиков в связи с ростом отраслей птицеводства и свиноводства; - повышение требований к качеству продукции птицеводства и свиноводства в связи с вступлением России в ВТО, в том числе требований по замене кормовых антибиотиков в рационах питания животных на пробиотики и фитобиотики и др. антимикробные кормовые добавки. Реализация проекта связана с выполнением разделов 5.6 «Биопрепараты для животноводства», 5.9 «Биологические компоненты кормов и премиксов» Комплексной программы развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года». В рамках контракта планируется создание экономически эффективного и экологически безопасного биопрепарата нового поколения для птицеводства и свиноводства на основе пробиотического микроорганизма Lactobacillus plantarum , который способен продуцировать в полуанаэробной среде желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственной птицы и свиней незаменимые аминокислоты, в том числе L-лизин. Штамм получен селекционным путем и использует желудочно-кишечный тракт как естественный биологический реактор. Разрабатываемый биопрепарат будет обладать высокой пробиотической активностью, повышать неспецифический иммунитет за счет влияния на микрофлору желудочно-кишечного тракта, способствовать увеличению продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, повышению качества продукции свиноводства и птицеводства. По совокупности характеристик и эффективности разрабатываемый продукт не имеет аналогов в мире. Предлагаемый к реализации проект может способствовать решению следующих проблем: • обеспечить продовольственную безопасность страны в сфере обеспечения населения птицеводческой продукцией; • создать экономическую основу для ускоренного устойчивого развития отечественного птицеводства и свиноводства, не зависящего от мировой конъюнктуры. По механизму действия аналогов данного биопрепарата в настоящее время нет. Для достижения цели проекта поставлены следующие задачи. Провести сравнительную оценку вариантов возможных решений исследуемой проблемы с учетом результатов прогнозных исследований, проводившихся по аналогичной тематике. Для этого будет использован Интернет-ресурс, в т.ч. научные базы данных ISI Web of Knowledge, http://apps.isiknowledge.com/, а также научные публикации, предоставляемые РФФИ, www.elibrary.ru, Национальной Медицинской Библиотекой США Национального института здоровья США, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/. Предложить штамм, продуцирующий лизин непосредственно в организме животного, и провести его комплексное исследование в соответствии с рекомендациями ФАО/ВОЗ, а именно: - изучить физиолого-биохимические, молекулярно-генетические и технологические свойства нового штамма Lactobacillus plantarum; - определить пробиотические свойства штамма, в том числе адгезию на линии эпителиальных клеток человека, и иммуномодулирующую активность; - изучить отношение штамма к антибиотикам различных групп с оценкой потенциальной опасности распространения трансмиссивных генов антибиотикоустойчивости; - определить механизм синтеза L-лизина новым штаммом Lactobacillus plantarum, установить необходимый уровень синтеза лизина, соответствующий суточной норме для сельскохозяйственной птицы и свиней, и предложить пути повышения синтеза L-лизина; - установить стабильность синтеза лизина штаммом Lactobacillus plantarum во время пересевов и хранения; - предложить методы контроля и идентификации штамма Lactobacillus plantarum во время промышленного производства и оборота. Разработать биопрепарат для обеспечения сельскохозяйственной птицы и свиней лизином in situ и техническую документацию на него: - создать модели для in vitro и in vivo тестирования функциональных свойств биопрепарата, в том числе бифидогенной активности, количества вводимого синтетического лизина в рационы птицы и свиней наряду с приемом разработанного биопрепарата; конверсии кормов в организме птицы и свиней; сохранности сельскохозяйственной птицы и свиней; - определить влияние штамма бактерии-продуцента лизина на микрофлору кишечника птицы с помощью молекулярно-генетического метода на основе T-RFLP-анализа. Исследовать эффективность штамма бактерии-продуцента лизина в птицеводстве путем определения следующих показателей в ходе исследований кормленческих и балансовых опытов на сельскохозяйственной птице: - сохранности поголовья путем учета отхода и установления его причин; - живого веса в динамике роста путем индивидуального взвешивания всего поголовья по группам; - потребления кормов группового, за весь период выращивания, кг на голову; - затрат корма на 1 кг прироста живой массы в конце опыта; - переваримости и использования питательных веществ корма по результатам физиологического опыта; - химического состава тканей и органов животного.

Основные планируемые результаты проекта:
1. В ходе выполнения НИР были получены следующие результаты:
- создан научно-технический задел, предназначенный для разработки и получения инновационного биопрепарата для обеспечения организма сельскохозяйственной птицы и моногастричных животных незаменимой аминокислотой лизином – методология;
- проведен аналитический обзор научно-технической, патентной, нормативной, методической литературы, затрагивающей проблему, исследуемую в рамках НИР;
- обоснованы и выбраны методы и средства исследований и способы решения поставленных задач;
- разработаны экспериментальные и методологические подходы к созданию инновационного биопрепарата с заданным составом и функциональными свойствами для обеспечения организма сельскохозяйственных животных лизином;
- разработаны программы и методики испытаний для оценки функциональных свойств, состава и качества экспериментального образца биопрепарата, содержащие описание методик и этапов исследований.
- разработана принципиальная схема проведения экспериментальных исследований.
- изучены фенотипические и молекулярно-генетические свойства штамма Lactobacillus plantarum.
- определены пробиотические свойства штамма, в том числе адгезии на линии
эпителиальных клеток человека, и иммуномодулирующей активности.
- изучены отношения штамма к антибиотикам различных групп с оценкой потенциальной опасности распространения трансмиссивных генов антибиотикоустойчивости.
- проведены молекулярно-генетические исследования микрофлоры кишечника кур для оценки пробиотической и бифидогенной активностей in vivo.
- определен потенциал штамма Lactobacillus plantarum по продуцированию L-
лизина в условиях балансового опыта на курах.

2. Основные характеристики планируемых результатов (в целом и/или отдельных элементов), планируемой научной (научно-технической, инновационной) продукции.

Штамм молочнокислой бактерии Lactobacillus plantarum – продуцента лизина;
Титр бактерий – не менее 106 КОЕ/г.
Ввод штамма бактерии Lactobacillus plantarum – продуцента лизина бройлерам позволил поднять сохранность до 100%.
При этом доступность лизина из кормов снизилась по сравнению с контролем на 2,8%.
Показатель конверсии вырос на 0,02 единицы (существенное значение).
Основные характеристики научно-технической продукции:
− промежуточный отчет о НИР;
− отчет о патентных исследованиях
− заявка на получение правоохранительных документов на объекты интеллектуальной собственности;
− проект технического задания на создание пилотного производства биопрепарата.
3. Оценка элементов новизны научных (технологических) решений, применявшихся методик и решений.
В работе использованы современные микробиологические, физиолого-биохимические и молекулярно-генетические подходы. Испытания на сельскохозяйственной птице соответствуют общепринятым мировым методикам.
4. Сопоставление с результатами аналогичных работ, определяющими мировой уровень.
Прямых аналогов проведенной работе нет. Впервые получен штамм молочнокислой бактерии, обладающей высокой пробиотической активностью и одновременно обладающей потенциалом к синтезу лизина в организме сельскохозяйственной птицы.
5. Пути и способы достижения заявленных результатов, ограничения и риски.
На первом этапе выполнения НИР существенных ограничений и рисков отмечено не было.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Описание областей применения планируемых результатов (области науки и техники; отрасли промышленности и социальной сферы, в которых могут использоваться или планируемая на их основе инновационная продукция);
Биотехнологии – производство биопрепаратов и кормовых добавок;
Птицеводство и свиноводство – использование биопрепаратов.

2. Описание практического внедрения планируемых результатов или перспектив их использования;
Внедрение разработки планируется на предприятии индустриального партнера – «Новгородский Бекон» (140 000 голов свиней и 2 млн. бройлеров) с последующим тиражированием на птицефабриках и свинокомплексах Российской Федерации.
3. Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие научно-технических и технологических направлений; разработка новых технических решений; на изменение структуры производства и потребления товаров и услуг в соответствующих секторах рынка и социальной сфере. Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие исследований в рамках международного сотрудничества, развитие системы демонстрации и популяризации науки, обеспечении развития материально-технической и информационной инфраструктуры.
В настоящее время проведение оценки затруднено.
Применение нового биопрепарата для выращивания птицы и свиней позволит значительно снизить затраты предприятий на специальные кормовые добавки и повысить конкурентоспособность продукции.

Текущие результаты проекта:
Лизин является незаменимой аминокислотой, которая в форме L-изомера входит в состав практически всех белков организмов млекопитающих. Он необходим для нормального формирования соединительной и костной тканей и их восстановления, участвует в синтезе антител, гормонов, ферментов, в процессах роста, усвоения кальция и поддержания нормального азотистого обмена. Выделяют также его нейротропную, иммуномодулирующую, антиметастазную, противовоспалительную, противовирусную, геропротекторную функции. Поскольку лизин является одной из лимитирующих аминокислот в рационе, как людей, так и животных, включение лизина в состав продуктов питания в ходе естественной ферментации молочнокислыми бактериями или дрожжами (например, ферментированных молочных продуктов, пива, силоса) могло бы значительно повысить их пищевую ценность и лечебно- профилактический эффект. Корма для животных, такие как фуражные сельскохозяйственные культуры, как правило, дефицитный по этой аминокислоте. В настоящее время дополнительное внесение этой аминокислоты в корма для животных для обеспечения оптимального роста – дорогостоящий процесс для фермеров и потребителей. Поэтому представляет значительный интерес повышение содержания незаменимых аминокислот в кормах на растительной основе. Использование суперпродуцентов L-лизина Lactobacillus plantarum в силосной ферментации (методе заготовки фуража с помощью молочнокислого брожения) может помочь в производстве обогащенного
лизином силоса.
Поскольку бактерии осуществляют регуляцию собственного биосинтеза аминокислот, они не производят концентрации лизина, превышающие потребности их роста. Так, Lactobacillus plantarum АТСС 8014, распространенный продуцент молочной кислоты, экскретирует менее 1 мкг/мл лизина при выращивании в свободной от лизина среде. Тем не менее, были зарегистрированы мутантные штаммы, которые синтезируют избыточные уровни лизина вследствие дефектных репрессорных систем или нефункционирующего ингибирования по принципу обратной связи. Рост микроорганизмов полностью ингибируется аналогом лизина S-2-аминоэтил-L-цистеином в таких низких концентрациях, как 5 мкг/мл. Для отбора спонтанных мутантов продуцентов лизина бумажные диски, пропитанные 2 мкг аналога, были размещены на поверхности среды для анализа лизина, содержащей 1,1% агара в качестве загустителя и засеянной L. plantarum. После 4 дней инкубации при 30 °С, спонтанные мутанты L. plantarum появляются в пределах зоны ингибирования. Способность этих спонтанных мутантов синтезировать лизин можно проверить методом посева штрихом на поверхность пластин твердой среды, засеянных штаммом Leuconostoc mesenteroides ATCC 8042, который требователен к лизину и используется в стандартных анализах. Колонии лактобацилл, которые обеспечивают максимальный рост тест-организма, изолируют и подвергают мутации и циклам селекции на твердых средах с целью получения штаммов L. plantarum, резистентных к уровню 5 мг аналога в диске.
Другим способом повышения продукции лизина бактериальными штаммами является генетическая рекомбинация и регуляция ферментативной активности. Такие ферменты как аспартаткиназа, аспартат-полуальдегид дегидрогеназа, дигидродипиколинатсинтаза и дигидродипиколинатредуктаза участвуют в биосинтезе L-лизина, и хотя последовательность генома свидетельствует о наличии генов, кодирующих изоферменты, некоторые из этих энзимов не проявляют очевидную ферментативную активность in vitro. Продукция L-лизина может быть усилена путем амплификации соответствующих генов Был выделен резистентый к S-2-аминоэтил-L-цистеину мутант L. plantarum, который продуцирует L-лизин на значительно более высоком уровне, чем родительский штамм. Аспартаткиназа мутанта была нечувствительна к ингибированию L-лизином по типу обратной связи. Анализ нуклеотидной последовательности thrA2, которая кодирует аспартаткиназу мутанта, показал замену глутамина на гистидин в положении 421. Гены L-лизин-нечувствительной аспартаткиназы и других ферментов были клонированы из ДНК L. plantarum в челночный вектор pRN14 и затем 2трансформированы в резистентные к аналогу мутантный и родительский штаммы. Гиперэкспрессия генов привела к увеличению активности кодируемых ферментов in vitro. Однако только штамм со сверхэкспрессией аспартаткиназы или дигидродипиколинатсинтазы выделял повышенные количества L-лизина. Был заложен модельный опыт на бройлерах кросса «Кобб 500». Цыплята –бройлеры получали основной рацион согласно рекомендациям для кросса и рекомендациям ВНИТИП (2010). В рацион питания цыплят вводили штамм бактерий Lactobacillus plantarum, продуцирующих лизин. В качестве контроля использовали основной рацион без добавки штамма и основной рацион с добавкой пробиотических препаратов (на основе бактерий родов Lactobacillus и Bacillus subtilis). На 35 сутки эксперимента планируется убой птицы, определение зоотехнических показателей, процента усвояемости аминокислот организмом. Планируется проведение отбора проб содержимого кишечника для определения бифидогенного потенциала штамма, в том числе в сравнении с контрольными пробиотическими препаратами, и влияния штамма бактерий на усвояемость аминокислот. Определение состава микробиоценозов кишечника будет проводится с применением молекулярно-генетических методов анализа. В рамках работ по внебюджетным средствам в соответствии с Приказом №172/2 от 10.06.2014 г. Генерального директора ООО "Новгородский бекон" Нисанова Р.Г. была создана рабочая группа для разработки проекта плана испытаний в рамках проекта. Была проведена работа, результатом
которой стал проект плана испытаний кормовой добавки на площади свиноводческого комплекса ООО "Новгородский бекон". Проект содержит Перечень работ по этапам в период с 01.01.2015 г. по 31.12.2016 г., временную инструкцию по применению кормовой добавки и методику сравнения полученных результатов с результатами контрольных групп. Было закуплено оборудование УЗИ Сканер для проверки поголовья и электролизный блок для установки получения гипохлорита натрия, являющегося более эффективной заменой, применяемого для обеззараживания воды жидкого хлора. Была закуплена часть ингредиентов кормов для свиней, свиней (лактирующих) и поросят. В настоящее время совершенствование свойств пробиотических штаммов-продуцентов лизина, в том числе Lactobacillus plantarum, поиски способов стимулирования биосинтеза аминокислоты и увеличения выхода, создание и скрининг суперпродуцентов лизина являются актуальным направлением пищевой и сельскохозяйственной биотехнологии. Способ отбора спонтанных лизин-выделяющих мутантов может быть использован для молочнокислых бактерий, используемых как в сельском хозяйстве, при производстве силоса, так и в животноводстве, путем внесения в корма в качестве пробиотических культур, синтезирующих лизин непосредственно в желудочно-кишечном тракте животных.