Регистрация / Вход
Прислать материал

Получение и иммунохимическое исследование рекомбинантных антител-кандидатов для комплексной профилактики и терапии заболеваний, вызванных вирусом Эбола

Докладчик: Долгих Дмитрий Александрович

Должность: в.н.с., профессор

Цель проекта:
1. Использование специфичных вирус-направленных рекомбинантных антител является на данный момент наиболее перспективным способом превентивной профилактики и терапии геморрагической лихорадки, вызванной вирусом Эбола. Главной задачей проекта является планирование, организация и проведение ПНИЭР с целью получения не менее 3-х рекомбинантных антител анти-Эбола, которые по своим характеристикам (аффинность, кросс- реактивность, эпитопная специфичность) позволят с высокой степенью вероятности рассчитывать на успешное проведение биологических испытаний их комбинированного терапевтического эффекта. 2. Исследование моноклональных антител и получение экспериментальных образцов рекомбинантных антител анти-Эбола как потенциальных компонентов нового терапевтического средства борьбы с лихорадкой Эбола.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Основными задачами проекта являются:
1) Получение и иммунохимическая характеризация представительного набора моноклональных антител
против компонентов вирусного капсида;
2) Разработка генетических конструкций и оптимальной системы экспрессии рекомбинантных антител
анти-Эбола;
3) Наработка в клеточных линиях млекопитающих, выделение и очистка не менее 3-х экспериментальных
образцов рекомбинантных антител анти-Эбола;
4) Иммунохимическая характеризация и валидация полученных экспериментальных образцов
рекомбинантных антител анти-Эбола.
2. В результате иммунизация мышей Balb/C рекомбинантным белком G вирусного капсида будет получен
новый представительный набор моноклональных антител.
Будут наработаны моноклональные антитела анти-Эбола из полученных ранее линий гибридом , а также полученные в результате иммунизации мышей белком G вируса Эбола. По результатам выполненных работ
будут отобраны (в количестве не менее 3-х) кандидатные моноклональные антитела анти-Эбола,
обладающие аффинностью, выраженной значением константы диссоциации комплекса антиген-антитело
не более 5 нМ. Будет проведено выделение генов вариабельных доменов кандидатных моноклональных антител анти-
Эбола, конструирование генов рекомбинантных антител анти-Эбола и системы их экспрессии.
Будут получены клеточные линии-продуценты СНО рекомбинантных антител анти-Эбола.
Будут получены экспериментальные образцы рекомбинантных антител анти-Эбола. Выход целевого
продукта после выделения и очистки (по данным иммуноферментного анализа) будет составлять не менее
60% от содержания целевого белка в среде культивирования. Степень очистки экспериментальных
образцов рекомбинантных антител анти-Эбола будет не менее 95% по данным гель-электрофоретического
и хроматографического анализов. Экспериментальные образцы рекомбинантных антител анти-Эбола будут
сохранять стабильность в физиологических условиях в течение не менее 3-х месяцев.
Будет проведена иммунохимическая характеризация рекомбинантных антител анти-Эбола и валидация на
соответствие свойствам исходных кандидатных моноклональных антител анти-Эбола.
3. Будет получен набор новых не являющихся дженериками моноклональных мышиных и созданных на их основе терапевтических антител.
При иммунизации и селекции антител-кандидатов будет использован комплекс методов, позволяющих добиться получения высокоаффинных нейтрализующих моноклональных антител. Принимая во внимание тот факт, что полученный за
рубежом препарат ZMapp представляет собой набор рекомбинантных химерных антител против белка G,
проведение новой иммунизации белком G и скрининг антител из новой панели является ключевым
фактором успеха предлагаемого проекта. В результате выполнения работы ожидается селекция
высокоаффинных антител, специфичных к различным, по возможности неперекрывающимся эпитопам
белка G.
4. Прорыв в профилактике и лечении геморрагической лихорадки Эбола наметился в последние несколько
месяцев в результате успешного испытания на нечеловекоподобных приматах композиции
терапевтических антител Zmapp. Данная композиция антител была создана в результате комбинирования антител двух разных серий рекомбинантных химерных антител, специфичных в отношении гликопротеина вирусной оболочки.
Сформированный в результате предварительных испытаний препарат Zmapp обеспечил 100% выживаемость у обезьян,
в том числе у инфицированных за 5 дней до введения антител. Ранее ни один из использованных белковых
и низкомолекулярных препаратов, а также использовавашихся моноклональных антител не позволял
достичь подобного уровня выживаемости.
В результате выполнения проекта должен быть получен представительный набор моноклональных антител против белка G, позволяющий значительно расширить терапевтические возможности пассивной иммунизации больных, зараженных вирусом Эбола.
5. Для выполнения данной задачи будет проведено выделение и определение нуклеотидной
последовательности генов вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей не менее 3-х кандидатных
моноклональных антител. Валидация первичной структуры вариабельных доменов будет проводиться
генетическими и масс-спектрометрическими методами и с На основе выделенных ДНК фрагментов будет
осуществлено конструирование генов полноразмерных рекомбинантных химерных антител. Полученные
гены будут интегрированы в экспрессионные вектора.
В отличие от препарата ZMapp, экспресированного и наработанного в листьях табака, в рамках данной
работы планируется разработка «классической» системы экспрессии рекомбинантных антител в клетках
яичников китайского хомячка СНО. В отличие от систем экспрессии в растениях, экспрессия в линиях
СНО позволяет получить рекомбинантные антитела с максимально приближенным к человеческому
профилю гликозилирования. Также процедура фармацевтической регистрации рекомбинантных антител,
полученных в линиях СНО, является значительно более распространенной и унифицированной.
Рекомбинантные химерные антитела анти-Эбола планируется конструировать на основе константных
доменов IgG1 иммуноглобулина человека с целью увеличения их стабильности и усиления иммунного
ответа против вируса.необходимом для проведения биологических испытаний, планируется получение стабильных клеточных
линий-продуцентов. Создание клеточных линий СНО - продуцентов рекомбинантных антител анти-Эбола
будет осуществляться с использованием уникальной установки - системы клональной селекции ClonePix
FL (Molecular Devices, Великобритания) с использованием метов автоматизированного флуоресцентного клеточного
сортинга.Будет проведено полноценное иммунохимическое исследование полученных образцов на соответствие
свойств рекомбинантных антител и исходных кандидатных моноклональных антител анти-Эбола.
Характеризация будет осуществляться в терминах специфичности и аффинности с использованием
рекомбинантных белков VP40 и G оболочки вируса Эбола. Наряду с этим задачами проекта являются разработка рекомендации по проведению биологических испытаний рекомбинантных антител анти-Эбола, разработка технических требований и предложения по
производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей
индустриального партнера, разработка технико-экономического обоснования дальнейшей разработки и
внедрения продукции.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Эпидемия геморрагической лихорадки Эбола представляет серъезную угрозу всему мировому сообществу.
Поэтому достижение целей проекта помимо коммерческой составляющей представляет несомненный
гуманитарный вклад в объединение усилий разных стран по борьбе с данной угрозой. Возникновение
эпидемии в 2014 г. позволяет прийти к неутешительному выводу, что эпидемии геморрагической
лихорадки Эбола могут иметь рецидивирующий характер.
В связи с данным обстоятельством представляется жизненно необходимым формирование наряду со
средствами вакцинации национального резерва терапевтических средств для борьбы с последствиями
заражения вирусом Эбола, а также индустриальных возможностей, позволяющих в короткие сроки
увеличить производство инъекционных форм рекомбинантных терапевтических средств на основе
моноклональных антител.
Потребителем результатов ПНИЭР и созданного на их основе фармацевтического препарата являются
организации Министерства здравоохранения, а также Министерства чрезвычайных ситуаций РФ.
2. Непосредственным индустриальным партнером проекта является Федеральное государственное унитарное
предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам
"Микроген" Министерства здравоохранения Российской Федерации (сокращенно – ФГУП НПО
«Микроген» Минздрава РФ) - ведущая профильная организация РФ в области разработки
иммунобиологических препаратов.ФГУП НПО «Микроген» Минздрава РФ обязуется участвовать непосредственно на стадии реализации
проекта, а также после его завершения. В ходе выполнения проекта данная организация обязуется
осуществить разработку и валидацию аналитических методов контроля качества рекомбинантных антител
анти-Эбола, проведение маркетинговых исследований и технико-экономической оценки рыночного
потенциала полученных результатов. Будет проведена разработка технических требований и предложения
по производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей
индустриального партнера, осуществлена разработка технико-экономического обоснования дальнейшей
разработки и внедрения продукции. По завершении проекта или в процессе его реализации ФГУП НПО «Микроген» Минздрава РФ планирует
организацию и проведение биологических испытаний полученных образцов рекомбинантных антител анти-
Эбола, а также проведение доклинических исследований.

Текущие результаты проекта:
Проект находится на стадии подписания Соглашения о субсидии.
Начата работа по составлению аналитического обзора информационных источников по теме проекта.
Начата разработка Плана экспериментальных исследований, направленного на получение рекомбинантных антител анти-Эбола.
Начаты экспериментальные исследования по выделению, наработке и очистке моноклональных антител анти-Эбола из полученной ранее панели гибридом.