Регистрация / Вход
Прислать материал

Использование показателей активности апоптоза в качестве биомаркеров воздействия генно-инженерно-модифицированных организмов на здоровье млекопитающих

Докладчик: Тутельян Виктор Александрович

Должность: директор, директор института, директор института, заведующий лабораторией

Цель проекта:
Оценка негативных последствий для здоровья человека, связанных с потреблением ГМО. Разработка научно-методической модели оценки токсичности генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) с использованием биомаркеров активности апоптоза.

Основные планируемые результаты проекта:
1-2. Ранее (за последнее десятилетие) при участии специалистов ФГБНУ «НИИ питания» были созданы законодательная, нормативная и методическая базы, регламентирующие требования к безопасности ГМ источников пищи в Российской Федерации. В рамках разработки подходов к оценке безопасности ГМО был определен перечень системных биомаркеров, наиболее чувствительных к токсическому воздействию, позволяющих выявить даже минимальные негативные влияния на организм – система биотрансформации ксенобиотиков, система антиоксидантной защиты, система перекисного окисления липидов, репродуктивная функция.
Дальнейшее совершенствование подходов к оценке безопасности ГМО направлено на поиск других информативных индикаторов, позволяющих выявить раннюю неспецифическую реакцию организма на низкотоксические воздействия. Для этой цели в настоящее время рассматривается возможность использования показателей, характеризующих выраженность процессов апоптоза. Индукция апоптоза в низких дозах, недостаточных для индукции некроза клеток и повреждения функции органов, подтверждена для многих токсических соединений. Эти данные свидетельствуют о высокой практической значимости методов оценки апоптоза при токсикологических исследованиях; апоптоз может быть первым признаком низкоэффективного токсического воздействия изучаемых веществ. Таким образом, определение активности апоптоза может быть эффективно использовано в исследованиях, направленных на изучение влияния экзогенных воздействий различной природы, в том числе, ГМ источников пищи.
В проведенном нами модельном эксперименте показано, что при активации апоптоза путем внутрибрюшинного введения крысам тетрахлорметана в очень низких дозах (0,08 и 0,48 мг/кг массы тела) отмечалось дозозависимое повышение активности апоптоза в печени, почках и костном мозге животных. Было также отмечено, что показатели апоптоза, оцененные разными методами, достигают максимума спустя 24 часа после низкотоксического воздействия. Помимо этого, при исследовании здоровых животных разных возрастных групп было обнаружено, что максимальная выраженность апоптоза в норме отмечается у новорожденных крысят, формирование различных органов у которых еще не завершилось; на следующих стадиях онтогенеза интенсивность апоптотических процессов снижается.
3. Впервые проведено скрининговое исследование разных временны́х точек отбора материала для оценки апоптоза; показаны закономерности изменения активности апоптоза по мере взросления подопытных животных, а также зависимость показателей апоптоза от времени, прошедшего после введения токсиканта.
4. Сопоставление с результатами аналогичных работ, определяющими мировой уровень.
По данным литературы, большинство изученных к настоящему времени токсических факторов оказывает влияние на молекулярные механизмы регуляции апоптоза [Orrenius et al., 2011]. Процесс программируемой гибели клетки может быть инициирован в результате прямого или опосредованного повреждающего действия в зависимости от свойств, дозы и времени экспозиции токсического агента [Orrenius et al., 2011; Raffray & Cohen, 1997]. Впервые влияние токсических факторов на изменение активности апоптоза было продемонстрировано на модели гибели тимоцитов и лимфоцитов под действием глюкокортикоидов. Впоследствии было установлено, что 2,3,7,8-тетрахлородибензо-п-диоксин также вызывает апоптоз тимоцитов [Kerr et al., 1972; Orrenius et al., 2011; Wyllie, 1980; Wyllie et al., 1980]. Гипотеза активации апоптоза в условиях умеренных токсических воздействий, недостаточных для развития некроза, в настоящее время поддерживается многими учеными. Получены многочисленные экспериментальные подтверждения данной гипотезы. На примере действия оксида мышьяка (As2O3) и 2,3-диметокси-1,4-нафтохинона на клетки поджелудочной железы, а также четыреххлористого углерода (ССl4) – на клетки печени, было показало, что низкие дозы этих веществ инициируют апоптоз, тогда как более высокие дозы приводят к некрозу. Аналогичные результаты были получены в исследованиях целого ряда других соединений: микотоксинов (фумонизины, охратоксин А), антибиотиков (циклогексимид, гигромицин и др.), солей тяжелых металлов (хлорид ртути, сульфат кадмия и др.) – изучено действие на клетки печени и почек; некоторых соединений свинца – на нейроны, астроциты и фоторецепторы сетчатки глаза; Т-2 токсина и 2,4- дихлорфеноксиуксусной кислоты – на клетки тимуса и селезенки; катехоламинов – на кардиальные и скелетные миоциты [Orrenius et al., 2011].
Таким образом, результаты наших экспериментов с тетрахлоруглеродом хорошо согласуются с литературными данными о влиянии на апоптоз других известных ядов.
5. Выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей проблемы влияния токсических и алиментарных факторов на выраженность апоптоза, а также сравнительные преимущества различных методов оценки выраженности апоптоза. Разработан план научно-исследовательской работы с использованием крыс в качестве подопытных животных. Выбраны органы-мишени для определения активности апоптоза при токсическом воздействии. В качестве методов оценки апоптозы были выбраны два чувствительных и современных метода, не требующих дорогостоящего оборудования: метод ДНК-комет и метод проточной цитофлуориметрии. Определены изменения активности апоптоза на разных этапах онтогенетического развития животных. Выработаны методические рекомендации по использованию двух вышеуказанных методов оценки активности апоптоза для определения негативного воздействия ГМО (а также других новых продуктов пищевой и лекарственной индустрии) на организм млекопитающих.
Ограничением разработанного метода является необходимость проведения комплексных медико-биологических исследований по оценке безопасности ГМО. Метод оценки выраженности апоптоза необходимо применять для оценки безопасности новых линий ГМО на биологических моделях только в комплексе с другими исследованиями для подтверждения отсутствия у данных ГМО общей токсичности, аллергенности и иммунотоксичности, генотоксичности, репродуктивной токсичности, мутагенности и других негативных влияний.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Полученные результаты (методические рекомендации по оценке выраженности апоптоза в качестве биомаркера негативного воздействия ГМО на организм млекопитающих) будут использованы при разработке и внедрении новых высокоэффективных биотехнологий в сфере производства пищевой продукции (продовольственного сырья и ингредиентов), что будет способствовать повышению производительности пищевой индустрии и повышению продовольственной безопасности страны.
2. Разработанный проект научно-методической модели оценки токсичности ГМО должен предназначаться для проведения дополнительных испытаний безопасности ГМО и может быть включен в процедуру обязательной государственной регистрации ГМО.
Возможными потребителями полученных результатов могут стать производители ГМО, заинтересованные в доказательстве безопасности своей продукции, а также испытательные лаборатории, осуществляющие проведение экспериментов по оценке безопасности пищевых продуктов.
3. Выполнение исследований возможного низкотоксического действия в дополнение к уже существующим обязательным методам оценки/прогнозирования негативных последствий для здоровья человека, связанных с потреблением продукции, полученной из/или с применением генно-инженерно-модифицированных организмов, в конечном итоге будет способствовать пополнению научно-обоснованной доказательной базы безопасности ГМО.
Увеличение объема научно-аргументированных данных о безопасности определенных видов ГМО должно привести к снижению общественной напряженности относительно безопасности этих видов ГМО и технологии генной инженерии в целом.
Такое увеличение доверия потребителей к современным биотехнологиям приведет к повышению заинтересованности производителей пищевого сырья в использовании высокопродуктивных сортов растений/пород животных, полученных с помощью современной биотехнологии. Итогом использования ГМО в отечественном сельском хозяйстве должно стать повышение объемов производства отечественной сельскохозяйственной продукции.

Текущие результаты проекта:
Выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках НИР, в том числе обзор научных информационных источников.
Определен перечень основных видов потенциальных угроз, возникающих при потреблении ГМО.
Исследованы, обоснованы и выбраны методы и средства, направления исследований и способы решения поставленных задач.
Разработан план научно-исследовательской работы с использованием экспериментальных моделей для исследований in vivo. Вид и линия подопытных животных, их пол и возраст, точки отбора материала для исследований, длительность эксперимента выбраны с учетом имеющегося научного задела по этой проблеме и данных научной литературы.
В соответствии с литературными данными и результатами собственных исследований выбраны наиболее оптимальные органы-мишени для определения активности апоптоза. Выбраны количественные и качественные показатели здоровья подопытных животных, не связанные с апоптозом (динамика массы тела, поедаемость корма, состояние шерстного покрова, размеры внутренних органов и др.).
Предложен комплекс методов (метод ДНК-комет и метод проточной цитометрии) для определения активности апоптоза в органах подопытных животных, направленный на выявление возможных негативных последствий, связанных с потреблением ГМО.
Выбран метод статистического анализа полученных результатов.
Определены границы физиологической нормы активности апоптоза у животных разного пола и возраста, а также оценены изменения активности апоптоза на разных этапах онтогенетического развития.
Разработана научно-методическая модель (методика) оценки токсичности ГМО с использованием биомаркеров активности апоптоза.