Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка ингибиторов ферментов репарации ДНК в качестве прототипов лекарственных препаратов для социально значимых заболеваний

Докладчик: Захаренко Александра Леонидовна

Должность: научный сотрудник ИХБФМ СО РАН, к.х.н., исполнитель проекта

Цель проекта:
1.1. Формулировка задачи/проблемы, на решение которой направлен реализуемый проект. Поиск ингибиторов ключевых ферментов и факторов репарации ДНК относится к перспективным направлениям медицинской химии и является одним из путей создания эффективной терапии сердечно-сосудистых, нейродегенеративных и онкологических заболеваний. Перечисленные патологии связаны с нарушениями экспрессии белков репарации, в том числе их гиперэкспрессией. Настоящий проект посвящен проблеме поиска ингибиторов трех ферментов репарации ДНК – перспективных фармакологических мишеней: поли(АДФ-рибозо)полимераз 1 и 2 (PARP1/2) и тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1 (Tdp1) и исследованию их цитотоксичности. PARP1 является участником различных путей репарации ДНК, что делает ее привлекательной терапевтической мишенью, поскольку ингибирование ее активности позволяет сенсибилизировать опухолевые клетки к действию химиотерапевтических препаратов. При использовании ингибиторов этого фермента в медицинских целях эксплуатируется, во-первых, избыточная экспрессия некоторых ферментов репарации в раковых клетках, во-вторых, отсутствие в некоторых видах раковых клеток определенных путей репарации, сохранных в здоровых клетках (т.н. синтетическая летальность). В то же время, ни один ингибитор PARP1 не получил пока разрешения на применение в терапии. Так, биологический эффект первого ингибитора PARP1 PJ34, достигшего III фазы клинических испытаний, оказался не связан с ингибированием PARP1. В отношении еще одного вещества, дошедшего до III фазы, инипариба, не подтвердились результаты, полученные на предшествующих стадиях испытаний. Помимо онкологических заболеваний, ингибиторы PARP перспективны при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, сопряженных с некротической гибелью клеток, таких как ишемия миокарда и инсульт. Это обусловлено тем, что ферменты PARP регулируют уровень НАД+ в клетке и вовлечены в механизмы клеточной гибели. Кроме того, участие PARP1 в нейрональном ответе на окислительный стресс делает этот фермент перспективной мишенью в лечении нейродегенеративных заболеваний. Необходимость PARP2, как и PARP1, для эффективного протекания репарации ДНК делает этот фермент такой же привлекательной терапевтической мишенью. Создание ингибиторов, проявляющих селективность в отношение PARP2, может расширить применимость комбинированной терапии (ингибитор+алкилирующий агент), поскольку открываются возможности избирательно подавлять эксцизионную репарацию оснований, при минимальном влиянии на функции PARP1, не связанные с системой ЭРО. Еще одной перспективной мишенью для лечения онкологических и нейродегенеративных заболеваний является тирозил-ДНК-фосфодиэстераза1 (Tdp1). Tdp1 играет важную роль в удалении повреждений ДНК, создаваемых топоизомеразой 1 (Top1), ее ингибитором камптотецином и антираковыми препаратами. Tdp1 расщепляет 3’-диэфирную связь между остатком тирозина и 3’-концом ДНК, а также удаляет другие повреждения с 3’-конца ДНК. Таким образом, Tdp1 противостоит ингибиторам Тор1, которые являются достаточно эффективными антираковыми препаратами. Предполагается, что именно Tdp1 ответственна за лекарственную устойчивость некоторых видов рака. Таким образом, сочетание препаратов, воздействующих на Тор1 и Tdp1, может существенно повысить эффективность химиотерапии. 1.2. Формулировка цели реализуемого проекта; конечного продукта, создаваемого с использованием результатов, планируемых при выполнении проекта; места и роли проекта и его результатов в решении задачи/проблемы. Формулировки даются в краткой форме, научно-популярным языком. Поиск низкомолекулярных ингибиторов ключевых ферментов репарации ДНК {тирозил-ДНК-фосфодиэстераза 1 (Tdp1) и поли(АДФ-рибозо)полимеразы 1 и 2 (PARP1/2)} и исследование активности наиболее эффективных соединений по отношению к выделенным ферментам и в культуре клеток. Созданные на основе разрабатываемых ингибиторов ферментов репарации ДНК препараты предположительно могут привести к разработке более эффективных и безопасных схемам лечения онкологических и/или нейродегенеративных заболеваний

Основные планируемые результаты проекта:
1. Краткое описание основных результатов (основные практические и экспериментальные результаты, фактические данные, обнаруженные взаимосвязи и закономерности).
В результате выполнения проекта планируется с помощью методов молекулярного моделирования и экспериментальных подходов выявить новые оригинальные ингибиторы Tdp1 и/или PARP1/2, эффективно подавляющие пролиферацию опухолевых клеток и в виде монопрепарата или в сочетании с клинически используемыми противораковыми лекарствами и являющиеся прототипами противоопухолевых препаратов.
Перечень ожидаемых научно-технических результатов:
Экспериментальные образцы соединений, обладающих ингибиторной активностью по отношению к PARP1/2 и/или Tdp1.
Лабораторные методики синтеза соединений
Лабораторная методика определения ингибиторных свойств соединений в реакции, катализируемой рекомбинантной Tdp1
Данные компьютерного моделирования фермент-ингибиторных комплексов
Данные по определению механизма действия соединений на активность ферментов
Данные по определению селективности соединений-лидеров по отношению к PARP1/2 и/или Tdp1.
Данные по определению влияния наиболее перспективных из найденных ингибиторов на клеточные культуры.

2. Основные характеристики планируемых результатов (в целом и/или отдельных элементов), планируемой научной (научно-технической, инновационной) продукции.
Молекулярный докинг соединений при компьютерном скрининге осуществляется с помощью программ Lead Finder, AmberTools, Amber.
Используемые для получения потенциальных ингибиторов PARP/Tdp1 методы синтеза и очистки обеспечивают высокую чистоту получаемых целевых соединений (не менее 95%). Структура полученных соединений подтверждена с помощью ЯМР; чистота подтверждена методом ВЭЖХ.
Скрининг соединений, являющихся потенциальными ингибиторами, проводится методом детекции флуоресценции в режиме реального времени, позволяющим определять начальную скорость реакции с высокой точностью.
Определение концентрации вещества, при которой наблюдается подавление активности фермента на 50%, (IC50) проводится с точностью не менее 20%.
Обнаруженные ингибиторы Tdp1 обеспечивают подавление ее активности наполовину при концентрациях от 0,2 до 6 мкМ. Структура амидов бензо[1,2,3,4,5]пентатиепина, к производным которого относятся все изученные ингибиторы, предусматривает возможность модификации по атому азота в первом положении, направленной на получение нужных свойств (усиление ингибиторного эффекта, усиление цитотоксичности в отношении опухолевых клеток, повышение селективности, снижение числа и интенсивности побочных эффектов и т.д.).
3. Оценка элементов новизны научных (технологических) решений, применявшихся методик и решений.
Разработанная методика определения ингибиторных характеристик соединений в отношении очищенного фермента Tdp1, основанная на использовании флуоресцентного олигонуклеотида, требует меньших затрат на синтез олигонуклеотидов и меньшего количества манипуляций по сравнению с имеющимися.
Обнаруженные ингибиторы Tdp1 на основе бензо[1,2,3,4,5]пентатиепина являются наиболее эффективными на сегодняшний день.
Впервые разработан ряд методов синтеза потенциальных ингибиторов PARP/Tdp1 – производных усниновой кислоты и адамантана
Впервые показано, что обнаруженный ранее ингибитор ПАРП1 7-метилгуанин в концентрации 150 мкМ не токсичен сам по себе, но усиливает цитостатическое действие цисплатина и доксорубицина на клеточные линии HCC1937 (рак молочной железы) и HCT116 (рак толстой кишки).
4. Сопоставление с результатами аналогичных работ, определяющими мировой уровень.
Ингибиторы PARP перспективны при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, сопряженных с некротической гибелью клеток, таких как ишемия миокарда и инсульт [Schuler & Ziegler, 2013; Ekblad, 2013; Mangerich & Bürkle, 2011; Murai, 2012]. Это обусловлено тем, что ферменты PARP регулируют уровень НАД+ в клетке и вовлечены в механизмы клеточной гибели. Кроме того, участие PARP1 в нейрональном ответе на окислительный стресс делает этот фермент перспективной мишенью в лечении нейродегенеративных заболеваний [см. обзор Mantha, 2013].
На сегодняшний день ряд ингибиторов проходит клинические испытания по данным Национальной академии здоровья США [ClinicalTrials.gov; Chen, 2011].
В то же время, ни один ингибитор PARP1 не получил пока разрешения на применение в терапии. Так, биологический эффект первого ингибитора PARP1 PJ34, достигшего III фазы клинических испытаний, оказался не связан с ингибированием PARP1 [Madison, 2011]. В отношении еще одного вещества, дошедшего до III фазы, инипариба, не подтвердились результаты, полученные на предшествующих стадиях испытаний [Liu, 2012; Patel, 2012]
Таким образом, по-прежнему необходима разработка новых соединений, эффективно подавляющих активность PARP1 и способствующих гибели опухолевых клеток.
Еще одной перспективной мишенью для лечения онкологических и нейродегенеративных заболеваний является тирозил-ДНК-фосфодиэстераза1 (Tdp1) [Cortes Ledesma, 2009]. Tdp1 играет важную роль в удалении повреждений ДНК, создаваемых топоизомеразой 1 (Top1), ее ингибитором камптотецином и антираковыми препаратами. Tdp1 расщепляет 3’-диэфирную связь между остатком тирозина и 3’-концом ДНК, а также удаляет другие повреждения с 3’-конца ДНК [см. Ben Hassine & Arcangioli, 2009 и ссылки там; Povirk, 2012]. Таким образом, Tdp1 противостоит ингибиторам Тор1, которые являются достаточно эффективными антираковыми препаратами [см. обзоры Pommier, 2010; Pommier, 2006]. Предполагается, что именно Tdp1 ответственна за лекарственную устойчивость некоторых видов рака [Dexheimer, 2008; Beretta, 2010]. В литературе описано немного ингибиторов Tdp1, и они обладают мягким ингибирующим действием (в диапазоне 100-5 мкМ) [Antony, 2007; Nguyen, 2012; Dexheimer, 2008]. Таким образом, ингибиторы Tdp1 могут увеличить цитотоксичность камптотецинов. Терапевтическим эффектом таких веществ может быть селективное увеличение активности ингибиторов Top1 в опухолях с нарушениями в процессах репарации ДНК и контроля клеточного цикла.
• Antony, S et al., Nucleic Acids Res. 2007, 35, 4474−4484.
• Ben Hassine S, et al., The EMBO Journal, 2009, 28, 632–640.
• Beretta GL, et al., Curr. Med. Chem. 2010, 17, 1500−1508.
• Chen A. Chin J Cancer., 2011, 30, 463-471.
• Cortes Ledesma F, et al., Nature, 2009, 461, 674-678.
• Dexheimer TS, et al., Anticancer Agents Med Chem. 2008, 8, 381–389.
• Ekblad T, et al., FEBS J, 2013, 280, 3563–3575.
• Liu X, et al., Clin Cancer Res., 2012, 18, 510-523.
• Madison DL, et al., DNA Repair (Amst)., 2011, 10, 1003-1013.
• Mangerich A., Bürkle A. Int. J. Cancer., 2011, 128, 251-265.
• Mantha AK, et al., Mitochondrion, 2013, pii: S1567-7249, 00272-9.
• Murai J, et al., Cancer Res., 2012, 72, 5588-5599.
• Nguyen TX, et al., J. Med. Chem., 2012, 55, 4457−4478.
• Patel AG, et al., Clin. Cancer Res., 2012, 18, 1655-1662.
• Pommier Y. Nat. Rev. Cancer, 2006, 6, 789–802.
• Pommier Y, et al. Chem Biol., 2010, 17, 421–433.
• Povirk LF. ISRN Mol. Biol., 2012, 1–16.
• Schuler H, Ziegler M. FEBS J, 2013, 280, 3542.

5. Пути и способы достижения заявленных результатов, ограничения и риски.
а). Создание компьютерных библиотек новых потенциальных ингибиторов Tdp1, PARP1/2 среди разных классов природных и синтетических соединений.
В проекте используется сочетание биоинформационных подходов, позволяющих проводить скрининг и моделирование взаимодействий низкомолекулярных соединений с Tdp1/PARP1/2, с методами экспериментальной проверки ингибирующего эффекта отобранных соединений на выделенных препаратах ферментов и на клеточных линиях. Для молекулярного моделирования комплексов Tdp1, PARP1 и PARP2 с ингибиторами используются вычислительные мощности суперкомпьютера СКИФ МГУ «Чебышев» и современное программное обеспечение для молекулярного докинга и молекулярной динамики (Lead Finder, AmberTools, Amber).
Создаются компьютерные библиотеки новых потенциальных ингибиторов в ряду различных синтетических и природных соединений и проведен компьютерный скрининг данных библиотек с целью отбора наиболее эффективных ингибиторов.
б). Скрининг библиотек с использованием полноатомных моделей ферментов и методов молекулярного докинга и структурной фильтрации, отбор наиболее перспективные соединения для экспериментального исследования.
В ходе скрининга используется разработанный авторами подход структурной фильтрации предсказанных позиций ингибиторов в активном центре, позволяющий увеличить эффективность предсказания путем отсева ложноположительных результатов (Захаренко и др., Молекуляр. биология 2011, 45, 565-569).
в). Молекулярно-динамическое моделирование механизма связывания наиболее перспективных ингибиторов с ферментом.
Для наиболее перспективных ингибиторов будет произведено молекулярно-динамическое моделирование с целью уточнения механизма связывания с ферментом.
г). Синтез отобранных соединений.
Применяются современные методики тонкого органического синтеза, физико-химические методы установления строения и подтверждения высокой оптической чистоты полученных соединений.
д). Характеризация способности отобранных синтезированных соединений подавлять активность выделенных препаратов Tdp1, PARP1/2, отбор наиболее перспективных ингибиторов для испытания на клеточных моделях онкологических заболеваний.
Игнибиторные свойства синтезированных соединений изучаются с использованием методик для определения ингибиторных свойств соединений в реакции автополи(АDP-рибозил)ирования, катализируемой рекомбинантными PARP1 и PARP2, разработанных коллективом ранее [Захаренко, 2011], в реакции, катализируемой рекомбинантной Tdp1 – с использованием адаптированной методики [Jensen, 2013].
е). Характеризация способности потенциальных ингибиторов Tdp1, PARP1/2 подавлять пролиферацию опухолевых клеток как в качестве монореагента, так и в при совместном использовании с препаратами, применяемыми в клинической практике для противоопухолевой терапии.
Проводится экспериментальное изучение влияния отобранных производных на пролиферацию перевиваемых линий опухолевых клеток. Оценка клеточной гибели проводится на проточном цитометре по методике измерения популяции sub-G1 или с помощью МТТ теста.
ж). Компьютерное моделирование фармакокинетических свойств и токсичности наиболее перспективных ингибиторов.
Моделирование фармакокинетических свойств и токсичности будет проведено с использованием пакета программ ACD/Labs.
Ограничения и риски:
К рискам можно отнести низкий терапевтический индекс, наличие существенных побочных эффектов, неудовлетворительные фармакологические свойства

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Описание областей применения планируемых результатов (области науки и техники; отрасли промышленности и социальной сферы, в которых могут использоваться или планируемая на их основе инновационная продукция);
Полученные соединения должны обеспечивать подавление активности ферментов PARP1/2 и/или Tdp1. Структуры соединений-лидеров должны предусматривать возможность дальнейших трансформаций, направленных на получение нужных свойств (усиление ингибиторного эффекта, усиление цитотоксичности в отношении опухолевых клеток, повышение селективности, снижение числа и интенсивности побочных эффектов и т.д.). Соединения должны быть предназначены для последующего создания на их основе препаратов, усиливающих действие алкилирующих противоопухолевых препаратов и/или ядов топоизмеразы 1 в комплексной противоопухолевой химиотерапии.

2. Описание практического внедрения планируемых результатов или перспектив их использования;
Для выяснения биологической активности предполагаемых ингибиторов Tdp1 и/или PARP1/2 представляется целесообразным исследовать влияние этих соединений на культуры клеток различного происхождения, а также животные модели различных заболеваний, связанных с функционированием указанных ферментов. Кроме того, целесообразно будет провести направленные трансформации соединений-лидеров с целью получения более эффективных ингибиторов Tdp1 и/или PARP1/2.

3. Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие научно-технических и технологических направлений; разработка новых технических решений; на изменение структуры производства и потребления товаров и услуг в соответствующих секторах рынка и социальной сфере. Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие исследований в рамках международного сотрудничества, развитие системы демонстрации и популяризации науки, обеспечении развития материально-технической и информационной инфраструктуры.
Созданные на основе разрабатываемых ингибиторов ферментов репарации ДНК препараты предположительно могут изменить структуру производства и потребления лекарственных препаратов в пользу отечественных производителей



Текущие результаты проекта:
1. Разработана методика определения ингибиторных характеристик соединений в отношении очищенного фермента Tdp1, основанная на использовании флуоресцентного олигонуклеотида. Методика предназначена для скрининга библиотек соединений в формате реального времени. Проведено предварительное определение ингибиторных характеристик известных производных бензо[1,2,3,4,5] пентатиепина по отношению к Tdp1. Обнаружены ингибиторы в микромолярном диапазоне, обнаружена зависимость ингибиторной активности от структуры и липофильности соединения. Проведено предварительное изучение влияния обнаруженных ингибиторов Tdp1 - производных бензо[1,2,3,4,5]пентатиепина на культуры опухолевых клеток. Обнаружена умеренная цитотоксичность веществ этого класса.
Обнаруженные ингибиторы Tdp1 не тестировались ранее в качестве таковых. Данные соединения обладают ингибиторными характеристиками, соответствующими мировому уровню, одно из них – наиболее эффективный ингибитор Tdp1, известный на сегодняшний день (значение IC50 220 nM). Представляется перспективным исследовать кинетический механизм действия наиболее эффективных ингибиторов Tdp1 этого класса, а также механизм апоптоза опухолевых клеток, вызываемого этими соединениями, и их влияние на выживаемость клеток в сочетании с ингибиторами топоизомеразы I.
2. Созданы компьютерные библиотеки классов природных и синтетических соединений - производных усниновой кислоты и адамантана - для проведения скринига потенциальных ингибиторов ферментов репарации ДНК. Проведен компьютерный скрининг библиотек потенциальных ингибиторов. В результате скрининга отобран ряд производных адамантана и усниновой кислоты для последующей экспериментальной проверки их ингибирующей активности в отношении Tdp1.
3. Разработаны методы синтеза потенциальных ингибиторов:
а) методики для синтеза на основе усниновой кислоты производных, содержащих различные структурные фрагменты:
i) тиазольный цикл
ii) флавоноидные фрагменты, в том числе открытоцепочечные соединения – хальконы, и гетероциклические – ауроны и флаваноны
iii) енаминопроизводные с варьированием типа заместителя
iv) сульфидные и сульфоновые фрагменты
б) методики для синтеза производных на основе адамантана:
i) 1- и 2-аминоадамантанов
ii) диазаадамантан-6-она.
4. Проведено экспериментальное изучение влияния 7-метилгуанина на пролиферацию опухолевых клеток. Показано, что 7-метилгуанин в концентрации 150 мкМ не токсичен сам по себе, но усиливает цитостатическое действие цисплатина и доксорубицина на клеточные линии HCC1937 (рак молочной железы) и HCT116 (рак толстой кишки). Таким образом, 7-метилгуанин способен усиливать эффективность существующих химиопрепаратов в случае комбинированного использования. Перспективным представляется провести доклинические испытания 7-метилгуанина в качестве антиракового препарата в сочетании с ДНК-повреждающими агентами, использующимися в клинической практике.