Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка технологии получения новых биосовместимых, биодеградируемых гидрогелевых изделий медицинского назначения на основе рекомбинантных белков паутины

Докладчик: Дебабов Владимир Георгиевич

Должность: научный руководитель института, Научный руководитель Института, заведующий лабораторией

Цель проекта:
Проект находится на стыке тканевой инженерии и материаловедения «умных полимеров» с заранее программируемыми свойствами. Актуальность проекта определяется его высокой социально-экономической значимостью – применение разрабатываемых медицинских изделий снизит количество осложнений, уменьшит время реабилитации, снизит инвалидизацию и уменьшит затраты государственных средств. До настоящего времени не существует универсального медицинского изделия для лечения ожогов различной глубины на всех стадиях течения раневого процесса. Известные разрабатываемые и рименяемые раневые покрытия имеют целый ряд недостатков. Классическая перевязка "от мокрого к сухому" уступила место "мокрым" покрытиям для ран, потому что именно "мокрые" покрытия обеспечивают миграцию клеток, диффузию регуляторных молекул и нормальную работу протеолитических ферментов. Кроме того, большинство раневых покрытий представляют собой пленки или гидрогелевые повязки, что позволяет использовать их для лечения только плоских ран. Имеющиеся гидрогелевые изделия удовлетворяют многим требованиям, предъявляемым к раневым покрытиям, и, кроме того, позволяют использование его при лечении глубоких ран и пролежней. Гидрогели медленно разлагаются и соединяются с тканями раны и внеклеточным матриксом, окружающим клетки, что ускоряет процессы заживления. Для успешной репарации необходимо, чтобы клетки могли, свободно передвигаться, чему способствуют влажная среда и наличие в ране опорного матрикса, состоящего из адгезивных молекул. В этом контексте гидрогели на основе рекомбинантного спидроина имеют преимущество перед гидрогелями на основе синтетических материалов: кроме того, что они обладают всеми полезными свойствами гидрогелей, они также характеризуются очень высокой способностью к адгезии и пролиферации клеток и обладают природным антибактериальным эффектом. Так, нами было показано, что материалы на основе рекомбинантного спидроина (в том числе гидрогели и микрогели) прекрасно адгезировали и поддерживали пролиферацию гепатоцитов, кардиомиоцитов, клеток кости, фибробластов, эпителиальных и мезенхимальных клеток, вызывали васкуляризацию и иннервацию в зоне дефекта при подкожном введении животным. Скорость их биодеградации соизмерима со скоростью регенерации новой ткани, а продуктами распада являются аминокислоты. Такая высокая биосовместимость должна сособствовать «правильной» регенерации поврежденной ткани и предотвращению образования шрамов и килоидных рубцов, что является одной из крупных и труднорешаемых проблем при лечении глубоких ран. Возможность решения этой проблемы должна компенсировать некоторое прогнозирумое превышение стоимости разрабатываемых нами изделий по сравнению со многими имеющимися на рынке гидрогелевыми изделиями на основе, в основном, синтетических материалов. Кроме того, разрабатываемые нами микрогели на основе рекомбинантного спидроина с размерами частиц в 100-300 мкм обеспечивают лучшую газо- и влагопроницаемость, могут быть нагружены любыми биологически активными соединениями и лекарствами и, при необходимости, могут легче вымываться из раны. Разрабатываемые в проекте медицинские изделия в виде гидрогеля и микрогеля на основе рекомбинантного белка паутины являются материалами, соответствующими трендам научно-технического развития в области лечения ожогов и регенерации тканей. Они могут быть наиболее востребованы в лечении глубоких ожогов и пролежней, а также в качестве имплантатов для замещения дефектов мягких и костных тканей. Цель проекта: Проект направлен на разработку промышленной технологии получения новых биосовместимых, биодеградируемых гидрогелевых изделий для регенеративной медицины и хирургии, обеспечивающих полное замещение устраняемых дефектов и повреждений собственными полноценными тканями организма. Уникальные свойства разрабатываемых медицинских изделий обеспечиваются использованием для их изготовления рекомбинантных аналогов белков паутины. По биосовместимости, динамике биодеградации, механическим свойствам белки паутины превосходят другие биополимерные материалы, используемые для медицинских целей.

Основные планируемые результаты проекта:
По окончании проекта планируется получить следующие результаты:
- Экспериментальный образец модифицированного штамма-продуцента рекомбинантного спидроина Saccharomices cerevisiae (далее - рекомбинантный спидроин).
 Экспериментальный образец рекомбинантного спидроина.
 Экспериментальный образец гидрогеля на основе рекомбинантного спидроина (далее – гидрогель).
 Экспериментальный образец микрогеля на основе рекомбинантного спидроина (далее – микрогель).
 Лабораторный регламент (далее ЛР) получения микробным синтезом рекомбинантного спидроина.
 ЛР получения гидрогеля.
 ЛР получения микрогеля.
 Проект Технических условий (ТУ) на рекомбинантный спидроин.
 Проект ТУ на гидрогель.
 Проект ТУ на микрогель.
 Регистрационное досье на изделия медицинского назначения в виде гидрогеля и микрогеля на основе рекомбинантных белков паутины для представления в МЗ РФ;
 Проект ОПР получения рекомбинатного спидроина.
 Проект ОПР получения гидрогеля и микрогеля на основе рекомбинатного спидроина.
 Технико-экономическое обоснование разработки продукции на основании полученных результатов.
 Проект ТЗ на ОТР «Разработка опытно-промышленной технологии получения субстанции рекомбинатного спидроина, гидрогеля и микрогеля на его основе».

1. Основные характеристики планируемых результатов (в целом и/или отдельных элементов), планируемой научной (научно-технической, инновационной) продукции.
 Модификация штамма-продуцента рекомбинантного спидроина должна повысить выход чистого рекомбинантного спидроина с 200 мг/л культуральной до не менее чем 260 мг/л культуральной жидкости (при урожае клеток 100 г/л).
 Усовершенствование процесса культивирования штамма-продуцента рекомбинантного спидроина при ферментации в 30-литровом ферментере должно давать не менее 150 г влажной биомассы дрожжей на 1 л культуральной жидкости.
 Модифицированный штамм-продуцент рекомбинантного спидроина при культивировании по усовершенствованной технологии должен давать не менее 490 мг рекомбинантного спидроина/л культуральной жидкости ( 3,3 г/кг влажной биомассы).
 Разрабатываемая лабораторная технология получения рекомбинантного спидроина должна обеспечивать возможность его получения до уровня 8 г/мес.
 Разрабатываемые масштабированные технологии должны обеспечивать получение 80 г рекомбинантного спидроина и 4 кг гидрогеля (микрогеля)/мес.
 Рекомбинантный спидроин должен иметь следующие характеристики:
 консистенция – ватообразная белого цвета;
 растворимость: не растворим в воде;
 не должен быть токсичным;
 электрофоретическая чистота не менее 95%;
 относительная молекулярная масса – 94,0 Кда;
 должен быть способен образовывать нити при экструзии раствора в спирт.
 Гидрогель на основе рекомбинантного спидроина должен иметь следующие характеристики:
 растворимость - не растворим в воде;
 концентрация рекомбинантного спидроина - в диапазоне от 2,5 до 4,0%;
 содержание воды – не менее 96% ;
 устойчивость к гидролитической деструкции – не менее 20 суток.
 обладать химической стабильностью в растворах слабых кислот и щелочей;
 обеспечивать адгезию и пролиферацию эукариотических клеток;
 отсутствие токсичности продуктов распада.
 обеспечение васкуляризации и иннервации in vivo.
 Микрогель, представляющий собой суспензию микрочастиц гидрогеля на основе рекомбинантного спидроина, должен иметь следующие характеристики:
 прозрачная суспензия, состоящая из гелеобразных частиц и водной или спиртовой фазы;
 не растворим в воде;
 не должен быть токсичным;
 концентрация рекомбинантного спидроина - в диапазоне от 2,5 до 4,0%;
 диаметр частиц в диапазоне 50 – 300 мкм;
 содержание воды – не менее 95%;
 устойчивость к гидролитической деструкции – не менее 20 суток.
 обладать химической стабильностью в растворах слабых кислот и щелочей;
 обеспечивать адгезию и пролиферацию эукариотических клеток;
 отсутствие токсичности продуктов распада.
 обеспечение васкуляризации и иннервации in vivo.
Масштабирование технологических процессов не должно приводить к уменьшению выхода искомого белка с единицы объема ферментационной среды.
Для повышения уровня экспрессии рекомбинантного спидроина будет проведена генно-инженерная модификация штамма-продуцента, приводящая к увеличению пула глицина и аланина в клетке, что важно для получения суперэкспрессии гена рекомбинантного спидроина, в котором остатки этих двух аминокислот составляют 74% от всех остатков. Для увеличения урожайности штамма и удешевления процесса ферментации будут проведены работы по оптимизации состава питательных сред, подбору растительных компонентов среды вместо компонентов животного происхождения и оптимизации самого процесса ферментации дрожжей. В рамках проекта эти методики будут многократно масштабированы – будет разработан способ культивирования клеток дрожжей-продуцентов в 100-литровом ферментере. С учетом этих модификаций планируется повысить выход искомого белка с нынешних 200 мг белка/л культуральной жидкости до 400-500 мг/л. При масштабировании процессов выделения и очистки рекомбинантного белка из клеток дрожжей будет разработана крупномасштабная технология ультрафильтрации растворов рекомбинантного белка вместо процесса диализа в лабораторном варианте. Имеющаяся лабораторная технология получения гидрогелей и микрогелей на основе рекомбинантного белка паутины ляжет в основу разработки проекта опытно-промышленных регламентов получения этих медицинских изделий. При этом будет разработан усовершенствованный дизайн изделий, способы стерилизации, упаковки и хранения. Будут разработаны методы контроля качества на всех этапах производства исходного материала и медицинских изделий. Будут проведены физико-химические и структурные (определение прочности, эластичности, водопоглощения, пористости, размеров частиц, электронная сканирующая и просвечивающая микроскопия, конфокальная микроскопия, сканирующая зондовая микроскопия), технические и медико-биологические (методы культивирования человеческих клеток in vitro и in vivo для определения способности к адгезии и поддержки пролиферации клеток in vitro, биодеградации, жизнеспособности клеток при культивировании, метод определения устойчивости материалов к деградации в модельных системах, способности к обеспечению васкуляризации и иннервации in vivo), испытания экспериментальных образцов рекомбинантного белка и медизделий на его основе с привлечением методов испытаний, рекомендуемых системой стандартов ГОСТ Р ИСО 10 993-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий», предъявляемым к имплантатам». В соответствии с этим ГОСТ-ом в сертифицированной лаборатории будут проведены доклинические испытания экспериментальных образцов рекомбинантного белка паутины, гидрогелей и микрогелей на его основе.
Основные риски работы – потенциальная неготовность рынка к подобным инновационным продуктам.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Основное применение полученные результаты и разработанные технологии производства медицинских изделий на основе рекомбинантного спидроина в виде гидрогелей и микрогелей найдут в регенеративной и восстановительной медицине для лечения глубоких ран и ожогов на второй стадии лечения. Высокая биосовместимость этих изделий должна сособствовать «правильной» регенерации поврежденной ткани и предотвращению образования шрамов и килоидных рубцов, что является одной из крупных и труднорешаемых проблем при лечении ран. Дополнительной областью применения может стать тканевая инженерия: создание имплантатов для замещения дефектов мягких и костных тканей, пациентов с патологиями опорно-двигательного аппарата и др., способствующих регенерации поврежденных тканей, в том числе, для создания биоискусственных органов и тканей (печень, почки, поджелудочная железа, миокард, хрящевая ткань, синовиальная жидкость, нейрогенная ткань) в качестве биоактивного каркаса. Также гидрогели на основе рекомбинантных аналогов белков паутины найдут применение в косметологии в качестве добавок в составы композиций для устранения возрастных изменений кожи.
Полученные результаты и разработанные методики будут ориентированы на широкое применение в научно-исследовательских организациях и фирмах-производителях наукоемкой продукции и будутконкурентоспособными на мировом рынке. Внедрение инновационных технологий с использованием биополимерных имплантатов на основе производных и аналогов природных биополимеров в клиническую практику позволит снизить необходимость хирургических вмешательств и уменьшить время реабилитации.
Результаты могут быть востребованы специализированными ЛПУ (ожоговые, онкологические, дерматовенерологические - при осложненных вторично инфицированных дерматитах, отделения гериатрии и педиатрии, родильные и гинекологические отделения, отделения ухода за лежачими больными, отделения пластической и реконструктивной хирургии, отделения травматологии и т.д.), медицинскими центрами и клиниками, научно-исследовательскими и медицинскими учебными институтами работающими в области восстановительной и заместительной хирургии, включая тканевую инженерию, такими как: НИИ скорой помощи им. Склифосовского, НИИ хирургии им. Вишневского, ФМБЦ им. А.И.Бурназяна ФМБА России, ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. В.И.Шумакова, «Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», частными компаниями, занимающимися производством медицинских изделий «Трикардикс» и «Мединж».
Для коммерциализации результатов в проекте участвует в качестве бизнес-партнера ЗАО «МосАгроген», г. Москва. Основные направления деятельности ЗАО «МосАгроген»: разработка и использование биотехнологических процессов; получение гормонов из сыворотки лошадей; разработка технологий получения ветеринарных препаратов; производство препаратов «Миксоферон» и «Кинорон» на основе рекомбинантного интерферона для ветеринарии (за эту разработку получена премия Правительства РФ по науке и технике за 1999 год). МосАгроген арендует 800 м2 площадей в ФГУП «ГосНИИгенетике». Штатное количество работников - 180 человек. Годовой оборот 900 млн. руб. Планируется в ближайшие годы организовать производство биодеградируемых гидрогелевых изделий медицинского назначения на основе рекомбинантного спидроина для лечения глубоких ран и ожогов, для косметологии и регенеративной медицины и вывод продукции на рынок.


Текущие результаты проекта:
Составлен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ. Проведен выбор и обоснование направления исследований, методы и средства изучения структуры и свойств полученных микробным синтезом рекомбинантного спидроина, гидрогелей и микрогелей из него. Проведены патентные исследования в соответствии ГОСТ Р 15.011-96. Разработана предварительная технологическая схема технологии получения рекомбинантного спидроина в лабораторных условиях.
1.1 Была проведена генно-инжнерная модификация штамма-продуцента рекомбинантного спидроина Saccharomices cerevisiae, в ходе которой для увеличения экспрессии рекомбинантного спидроина 1 – белка 1F9 в рамках проекта использован метод усиления экспрессии тРНК в клетках дрожжей S.cerevisiae, при этом увеличение экспрессии белка 1F9 достигается не за счет увеличения экспрессии редких тРНК, а за счет гиперэкспрессии тех тРНК, в отношении использования которых в генах дрожжей S.cerevisiae и в гене белка рекомбинантного спидроина 1F9 наблюдается более чем 3-кратный дисбаланс, то есть тРНК - переносчиков аланина и глицина. Увеличение экспрессии тРНК было достиигнуто за счет увеличения дозы генов тРНК, для чего эти гены ввели в состав многокопийных векторов экспрессии (копийность векторов - от 15 до 50 копий на геном), на которых размещен ген белка 1F9. Это привело к повышению уровня продукции искомого белка на 30%. (с 200 мг/л культуральной жидкости до 260 мг/л при урожае клеток 100 г/л). Если для достижения оптимального баланса использования кодонов в клетках бактерий эффективно применяются оба подхода – замена кодонов в экспрессируемом гене и/или увеличение экспрессии редких тРНК, то в клетках дрожжей метод увеличения экспрессии целевого белка за счет усиления экспрессии редких тРНК пока не описан. В ходе усовершенствования процесса культивирования штамма-продуцента проведена оптимизация состава питательных сред (подобраны растительные компоненты среды вместо компонентов животного происхождения), подобран состава и условия подачи подпитки – исключен один из этапов подпитки сахарозой, что привело к увеличению урожая клеток со 100 г/л до 130 г/л и увеличению удельного содержания целевого белка с 2 г/кг до 3,3 г/кг. Переход на процесс с одной подпиткой позволил упростить ферментацию, сделав ее более удобной для оптимизации. Обнаружено, что введение некоторых солей органических кислот в состав подпитки увеличивает скорость роста культуры в 2–4 раза и позволяет получать в 1,5-2 раза больший урожай клеток (до 240 г/л) за меньшее время (за 42–44 ч вместо прежних 68–72 ч). При этом сохраняется прежний высокий уровень содержания целевого белка 1F9. Полученные результаты выводят процесс на высокий уровень рентабельности и могут стать основой для оформления ноу хау. В ходе усовершенствования стадии экстракции рекомбинатного спидроина из водонерастворимой фракции клеток дрожжей проработан вариант с введением предварителльной стадии экстракции, что приводит к упрощению стадии хроматографии и повышению выхода искомого белка. В ходе усовершенствования стадии очистки рекомбинатного спидроина в лабораторныхусловиях путем оптимизации условий проведения хроматографии была исключена одна из стадий хроматографического процесса, что упростит процесс. Разработан способ стерилизации рекомбинантного спидроина.
Разработаны ПМ ИИ отдельных операций изготовления экспериментальных образцов рекомбинатного спидроина из биомассы генно-модифицированного штамма-продуцента и экспериментальных образцов рекомбинатного спидроина, проведена наработка экспериментальных образцов и проведены ИИ (исследовательские испытания) отдельных операций изготовления экспериментальных образцов и исследования технических и физико-химических свойств экспериментальных образцов рекомбинантного спидроина. Разработаны ПМ ИИ экспериментальных образцов гидрогеля и микрогеля, приготовленных из экспериментальных образцов рекомбинатного спидроина, наработаны экспериментальные образцы гидрогеля и микрогеля и проведены исследования их технических, физико-химических и медико-биологических свойств. Разработана лабораторная методика длительного хранения генно-модифицированного штамма-продуцента рекомбинатного спидроина. На культуре клеток показана биобезопасность продуктов распада образцов гидрогелей и микрогелей.