Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка технологии производства высокоаффинных моноклональных антител на примере получения антител к онкомаркеру Her2 с пикомолярными значениями константы диссоциации, Kd.

Докладчик: Зарипов Михаил Махмудович

Должность: научный сотрудник, кандидат биологических наук

Цель проекта:
Моноклональные антитела широко используются в различных областях науки и народного хозяйства. Существующий классический путь получения моноклональных антител с помощью гибридомной технологии - длительный, технически громоздкий процесс, обычно с невысоким выходом. Разработка и внедрение недорогой экспресс-технологии получения моноклональных антител с высокой аффинностью позволят революционизировать эту область биологии, полностью заменив классическую гибридомную технологию получения мышиных моноклональных анитител. Целью выполнения ПНИ является разработка технологии, позволяющей получать моноклональные антитела с пикомолярными значениями констант диссоциации в течение одного месяца. Разрабатываемая технология предназначена для получения моноклональных антител в условиях лаборатории молекулярно-биологического профиля среднего уровня укомплектованности. По предварительной оценке, применение новой технологии сокращает время получения моноклональных антител минимум в 2 раза и удешевляет стоимость работ в 3 раза. Полученные таким образом продукты, в силу более высоких качественных характеристик, могут быть использованы не только в научных исследованиях, но и в разнообразных биосенсорных устройствах, уровень чувствительности которых минимум на 1-2 порядка будет превышать таковую при использования традиционных подходов. Высокоаффинные антитела востребованы в медицине как для применения в экспресс-диагностикумах, так и для создания новых терапевтических антител, характеризующихся резким снижением эффективной дозы, и как следствие уменьшением побочных эффектов и удешевлением стоимости готовых лекарственных средств.

Основные планируемые результаты проекта:
Основные планируемые результаты:
1. Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ, содержащие: а) обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ; б) результаты теоретических исследований по разработке Программы и методик исследований; в) результаты экспериментальных исследований; г) обобщение и выводы по результатам ПНИ; д) рекомендации и предложения по использованию и реализации результатов ПНИ, в том числе в реальных секторах экономики.
2. Лабораторный регламент получения высокоаффинных моноклональных антител.
3. Экспериментальные образцы высокоаффинных моноклональных антител к онкомаркеру Her2 с показателями аффинности в пикомолярном диапазоне значений Kd.
4. Техническое задание на проведение ОТР по теме «Разработка опытно-промышленной технологии получения высокоаффинных моноклональных антител».

Разрабатываемая технология должна обеспечивать следующие основные параметры, определяющие количественные, качественные и
стоимостные характеристики продукции.
1) продолжительность процедур по получению моноклональных антител - не более 1 месяца;
2) аффинность получаемых антител - Kd не более 1pM;
3) продукция рекомбинантных антител в HEK293 - не менее 1 г/л;
4) для выполнения технологических процедур должно быть достаточно одного оператора;
5) должна использоваться кровь в объёме 20-30 миллилитров, отобранная у животного обычным, щадящим способом через ушную вену;
6) в сравнении с традиционными технологиями применение разрабатываемой технологии должно сократить время получения моноклональных антител не менее, чем в 2 раза, и удешевить стоимость работ не менее, чем в 3 раза.

Новизна предлагаемых научных и технологических решений настоящего ПНИ заключается в том, что
1. объектом генетических манипуляций исходно является единственная клетка, или совокупность идентичных, клонально экспансированных клеток, что гарантирует от изначальной рандомизации, - такого неотъемлемого события, являющегося огромным недостатком, заложенным, например, в технологии дисплейного подхода, поскольку постулируется, что любая синтетическая, рандомизированная библиотека не может содержать последовательности для более аффинных антител, чем в исходном материале.
2. собственно процедуры манипуляций с нуклеиновыми кислотами, обратная транскрипция и амплификация, венчают разрабатываемый технологический процесс, а не начинают его, как в случае дисплейных подходов. Таким образом собственная предвзятость каждой из этих процедур никак не отражается на разнообразии конечной библиотеки цепей иммуноглобулинов, при условии принципиальной технической возможности их применения к конкретной генетической последовательности.
3. предлагаемый метод не имеет стадий экспрессии полипептидых последовательностей иммнуоглобулинов в гетерологичных системах, таких какими являются системы экспрессии в клетках прокариот или дрожжей, а следовательно они не накладывают присущие им биосинтетические ограничения, такие, как например оптимальность кодонов, специфичность гликозилирования, собственная токсичность последовательностей иммуноглобулинов и т.д.
4. в отличие от классического варианта гибридомной технологии, при которой жертвуется целое животное ради клеток селезёнки, в предлагаемом подходе используется кровь в объёме 20-30 миллилитров, отобранная у животного обычным, щадящим способом через ушную
вену. При этом животное может быть использовано многократно, что тем более ценно, поскольку повторные иммунизации приводят к увеличению аффинности антител.

Сегодня в данном направлении мировой уровень определяют работы, проводимые исследовательскими группами из Японии и Германии. Японские исследователи исповедует истинно моноклеточный подход, который реализуют с помощью специально изготовленных чипов с привлечением технологий смежных японских специализированных фирм. Разработанные и используемые ими чипы позволяют проводить анализ и извлечение генетической информации иммуноглобулинов у массива из более чем 200000 В-лимфоцитарных клеток. Японская технология использует разработанный ранее их группой эффективный способ синтеза кДНК, позволяющий получать необходимые количества матрицы для дальнейшей амплификации с помощью полимеразной цепной реакции. Немецкие исследователи адаптировали методику к обычным 96-луночным планшетам. Вторым принципиальным отличием немецкой технологии является то, что в ней применяют индуцирование клонального роста с помощью культивирования индивидуальных В-лимфоцитов с кондиционированными средами и в присутствии вспомогательных клеток, секретирующих факторы, поддерживающих клональный рост В-лимфоцитов. Преимуществами немецкой технологии являются возможность проведения большего числа анализов культуральной жидкости, а так же большего удельного
количества секретирующих клеток. Обе технологии, опубликованные в 2012 и 2014 годах, продемонстрировали успешное применение к получению кроличьих антител. Обе технологии показали возможность получения гомогенных моноклональных антител в течении 7 или 16 дней после забора крови от иммунизированного животного.
Разработка предлагаемой нами экспресс-технологии получения моноклональных антител с высокой аффинностью, включающей наиболее эффективные элементы японской и немецкой технологий, а также наши собственные заделы, позволила бы революционизировать эту область биологии, полностью заменив классическую гибридомную технологию получения мышиных моноклональных антител.

Разработку технологии предлагается осуществить на примере получения антител к онкомаркеру Her2, имеющих высокий научный и коммерческий потенциал. Путь достижения заявленных результатов заключается в успешном выполнении следующих этапов работы:
1) получение рекомбинантного человеческого Her2 с использованием имеющихся в лаборатории библиотек человеческой кДНК и его характеристика;
2) разработка и адаптация высокочувствительной системы экспресс-скрининга В-клеток - продуцентов Нer2-специфических антител, основанной на использовании флуоресцентно-меченного Her2 и позволяющей проводить отбор высокоаффинных антител;
3) разработка парных плазмидных эукариотических ДНК-векторов для интегрирования вариабельных фрагментов лёгкой и тяжелой цепей кроличьих иммуноглобулинов способом.
4) адаптация высокоэффективного метод амплификации кДНК цепей иммуноглобулинов из единственной антитело-продуцирующей клетки (В-лимфоцита, плазмацита);
5) клонирование, экспрессия, очистка и анализ полученных рекомбинантных антител с помощью независимых аналитических средств (Биакор);
6) оценка терапевтического потенциала полученных антител на модели мыши линии Nude и клеток человеческого рака молочной железы MCF-7;
7) секвенирование наиболее перспективных из полученных моноклональных антител в целях архивирования в виде электронных файлов.

Основным риском настоящего проекта ПНИ является отсутствие/уменьшение финансирования.






Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Высокоаффинные моноклональные антитела могут быть использованы
- в научных учреждениях (МОН РФ, МЗ РФ, Минсельхоз РФ, РАН и др.) при проведении исследований;
- в различных министерствах и ведомствах (МОН РФ, МЗ РФ, Минсельхоз РФ, РАН, МО РФ,
Роспотребнадзор и др.) в диагностикумах и тест-системах для высокочувствительного анализа
биологических объектов;
- в фармацевтической промышленности для получения высокоэффективных лекарственных средств на
основе моноклональных антител.

Таким образом, разработанная технология обеспечит
— предоставление научно-исследовательским организациям новых и эффективных методов и средств проведения исследований;
— получение значимых научных результатов, позволяющих переходить к созданию новых видов научно-технической продукции;
— вывод на рынок новой научно-технической продукции, разработки технологий мирового уровня;
— экспортный потенциал и замещение импорта.

Разработка и внедрение предлагаемой нами технологии получения моноклональных антител с высокой аффинностью оказали бы колоссальное влияние на развитие практически всех областей современной биологии, а также фармацевтики и диагностики.

Текущие результаты проекта:
На данном этапе выполнен аналитический обзор научно- технической, нормативной, методической литературы.
Проведены патентные исследования. Разработана Программа и методики экспериментальных исследований.
Получен препарат нативного рекомбинантного Her2. Изучены физико-химические свойства белка. Разработаны схема иммунизации и методики экспресс-скрининга В-клеток - продуцентов Нer2-специфических антител. Разработан новый простой метод получения аналитических количеств меченых моноклональных антител для подбора пар в сэндвич-варианте ИФА. Таким образом, работы первого этапа ПНИ выполнены полностью.