Регистрация / Вход
Прислать материал

Экспериментальное моделирование и разработка ранней диагностики болезни Паркинсона.

Докладчик: Угрюмов Михаил Вениаминович

Должность: Заведующий лабораторией, Зав. лаборатории

Цель проекта:
Цель: создание хронических моделей доклинической и ранней клинической стадий болезни Паркинсона и разработка методов комплексной ранней диагностики заболевания. Задача 1. Создание хронической модели доклинической (отсутствие нарушений двигательной функции) стадии болезни Паркинсона (БП) на мышах с помощью МФТП(1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин, токсин дофаминергических нейронов и оценка гибели нейронов и компенсаторных процессов в нигростриатной системе мозга. Планируется создать хроническую модель доклинической стадии БП и дать оценку функционального состояния нигростриатной системы мозга как ключевого звена регуляции моторного поведения. Модель должна удовлетворять следующим требованиям: (1) допороговый уровень деградации нигростриатной ДА-ергической системы, т.е. потеря менее 50% тел нейронов в черной субстанции и менее 70% аксонов и ДА в стриатуме; (2) отсутствие нарушений моторного поведения; (3) системный характер нейродегенерации; (4) длительный период постепенной дегенерации нейронов; (5) хорошая воспроизводимость. Несмотря на существование многочисленных моделей БП - нейротоксических, создаваемых с помощью специфических токсинов ДА-ергических нейронов, и трансгенных, обычно имитирующие гиперпродукцию альфа-синуклеина - неспецифического нейротоксина, ни одна из моделей не удовлетворяет всем предъявляемым нами требованиям. Задача 2. Создание хронической модели ранней клинической (появление нарушений двигательной функции) стадии БП на мышах с помощью МФТП и комплексная оценка гибели нейронов и компенсаторных механизмов в нигростриатной системе мозга. Несмотря на большое количество работ по моделированию БП у грызунов с помощью экзогенных нейротоксинов или у трансгенных мышей с повышенным уровнем экспрессии эндогенных нейротоксинов, эти модели, как правило, имитируют терминальную клиническую стадию, характеризующуюся деградацией большинства нигростриатных ДА-ергических нейронов и истощением компенсаторных резервов мозга. Учитывая необходимость в данном проекте оценить специфичность периферических биомаркеров, которые предполагается обнаружить у мышей на досимптомной стадии паркинсонизма (см. задача 4), по отношению к контролю и к ранней клинической стадии, в рамках данного проекта будет разработана на мышах хроническая модель ранней клинической стадии БП. Задача 3. Оценка функционального состояния отделов мозга за пределами нигростриатной системы и периферических органов на модели доклинической стадии БП. Создавая модели различных заболеваний, включая БП, необходимо быть уверенным в том, что они воспроизводят основные элементы патогенеза у человека. Поэтому решение задачи 3 направлено на проверку адекватности хронической модели доклинической стадии БП патогенезу этого заболевания у человека. Для этого будут проведены исследования, которые покажут, происходят ли у животных, как и у больного на доклинической стадии БП, системные изменения - нарушения функциональной активности ряда центров мозга и периферических органов на фоне допороговой деградации нигростриатной ДА-ергической системы. Для этого у животных на модели доклинической стадии БП планируется оценить: (а) в гипоталамусе метаболизм ДА, число ДА-синтезирующих нейронов, (б) в гипофизе и в крови содержание пролактина и альфа-меланоцит-стимулирующего гормона, секреция которых находится под ингибиторным контролем ДА-ом гипоталамуса; (б) метаболизм норадреналина в синем пятне и серотонина – в ядрах шва ствола мозга; (г) в надпочечниках метаболизму норадреналина. Задача 4. Поиск биомаркеров в крови на моделях доклинической и ранней клинической стадий БП как основа для создания ранней диагностики БП. В данном проекте будет осуществлен поиск биомаркеров на модели доклинической стадии БП в виде изменения содержания (по сравнению с контролем) в плазме крови: (а) моноаминов и метаболитов, (б) гормонов гипофиза (пролактин, альфа-меланоцит-стимулирующий гормон) и периферических эндокринных желез (катехоламины и глкокортикоиды надпочечников), (в) ростовых факторов, секреция которых в мозге и на периферии значительно меняется при нейродегенерации и развитии компенсаторных процессов, патологического белка – α-синуклеин, экспрессия которого при БП резко увеличена в нейронах мозга и на периферии, а также в лимфацитах. Задача 5. Экспериментальная разработка провокационного теста диагностики БП на модели доклинической стадии Задача состоит в том, чтобы на модели доклинической стадии БП временно усилить функциональную недостаточность ДА-ергический системы, снизив уровень ДА в стриатуме до порогового, при котором должны проявиться обратимые нарушения моторного поведения. Аналогичное воздействие на нормальных животных (контроль) должно также привести к снижению содержания ДА, однако, на допороговом уровне и без нарушений моторного поведения. В качестве провокационного фактора, способствующего снижению уровня ДА в стриатуме, будет использован α-метил-п-тирозин, обратимый ингибитор тирозингидроксилазы - первого скорость-лимитирующего фермента синтеза ДА, при его системном введении. При этом необходимо: (1) осуществить подбор минимальной дозы α-метил-п-тирозина, вызывающей нарушение моторного поведения у мышей на досимптомной стадии, но не влияющей на поведение мышей в контроле; (2) оценить последствия введения α-метил-п-тирозина на функционирование нигростриатных ДА-ергических нейронов и подтвердить обратимость его действия; (3) оценить возможные побочные эффекты. Важно подчеркнуть, что использование α-метил-п-тирозина разрешено в клинике, однако, пока только для лечения, например при феохромоцитоме.

Основные планируемые результаты проекта:
В результате выполнения первой и второй задач проекта планируется впервые создать хроническую модель болезни Паркинсона (БП) на грызунах (мышах) с помощью 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) – предшественника, нейротоксина дофаминергических (ДА-ергических) нейронов, который в организме превращается в активный токсин МФП+. Предполагается, что введение МФТП в дозе, вызывающей по нашим предыдущим данным, минимальную деградацию ДА-ергической системы, с интервалом в несколько дней, сопоставимым по продолжительности с периодом дегенерации ДА-ергических нейронов, будет сопровождаться постепенной медленной деградацией нигростриатной ДА-ергической системы, что характерно для больных. При этом также впервые будут смоделированы на грызунах одновременно две ключевые стадии БП – доклиническая и ранняя клиническая. Первая будет характеризоваться допороговым уровнем деградации нигростриатной ДА-ергической системы, важнейшим показателем которой является потеря ДА в стриатуме менее чем на 70%, а вторая – пороговым уровнем деградации этой системы при потере в стриатуме более 80% ДА, что должно привести к нарушению моторного поведения.
Использование моделей доклинической и ранней клинической стадий БП позволит приблизиться к пониманию клеточных и молекулярных механизмов патогенеза БП у человека путем оценки: (а) скорости деградации нигростриатных ДА-ергических нейронов у человека при наличии в его организме сходного по строению и механизму действия эндогенного нейротоксина; (б) клеточных и молекулярных механизмов компенсаторных процессов в нигростриатной системе, направленных на усиление синтеза ДА выжившими ДА-ергическими нейронами и недофаминергическими нейронами, экспрессирующими одиночные комплементарные ферменты синтеза ДА, а также на повышение чувствительности нейронов-мишеней к дефицитному ДА; (в) молекулярных механизмов, обусловливающих появление нарушений моторного поведения и переход из досимптомной стадии в симптомную. Авторы проекта надеются также впервые получить доказательства того, что с помощью МФТП можно моделировать не только деградацию нигростриатной ДА-ергической системы – ключевого звена патогенеза БП, но и имитировать системный характер заболевания, т.е. распространение патологического процесса по мозгу за пределы нигростриатной системы и на периферию. Было бы особенно важно показать, что эти неспецифические патологические процессы развиваются раньше, чем деградация нигростриатной ДА-ергической системы достигает порогового уровня и появляются нарушения моторного поведения.
Создание и анализ моделей доклинической и ранней клинической стадий БП позволят не только получить новые фундаментальные знания о патогенезе БП, но будут способствовать созданию комплексной диагностики БП на доклинической стадии. Так, у мышей на модели доклинической стадии БП предполагается выявить ряд относительно специфичных биомаркеров в плазме крови в виде изменения содержания моноаминов, гормонов, ростовых факторов и патологических нейротоксических белков, на базе которых в совокупности можно построить раннюю диагностику БП задолго до появления первых моторных симптомов. Используемый нами оригинальный экспериментальный подход к разработке доклинической диагностики БП является комплементарным к поиску биомаркеров в плазме крови у больных сразу же после появления у них симптомов нарушения двигательной функции, но до начала патогенетического лечения, что в настоящее время широко осуществляется в России и в зарубежных странах. Сравнительный анализ биомаркеров, выявляемых в плазме на разработанных нами моделях доклинической и ранней клинической стадий, позволит понять, в какой степени они перекрываются, а значит, в какой степени можно рассчитывать на то, что обнаруженные у больных биомаркеры в плазме на ранней клинической стадии могут служить диагностическими маркерами и у больных на доклинической стадии.
Важнейшим «ноу хау» в разработке доклинической диагностики БП, не имеющим в мире аналогов, будет создание провокационного фармакологического теста, с помощью которого можно обратимо на короткое время усугубить функциональную недостаточность нигростриатной ДА-ергической системы, доведя дефицит ДА в стриатуме до порогового уровня. При этом у животных в опыте, но не в контроле, должны возникнуть обратимые кратковременные нарушения моторного поведения. В качестве такого антагониста ДА предполагается использовать альфа-метил-п-тирозин – обратимый ингибитор тирозингидроксилазы - первого скорость-лимитирующий фермент синтеза ДА, действие которого при введении в организм ограничивается двумя-тремя часами. Перспективность использования этого ингибитора в клинике в качестве провокационного агента обусловлено тем, что он уже используется в клинике, но с другой целью – для лечения таких заболеваний, как феохромоцитома. Это означает, что альфа-метил-п-тирозин прошел в свое время клинические испытания, показавшие не только его эффективность как лекарственного средства, но и отсутствие побочных эффектов. Предполагается, что в результате выполнения проекта на экспериментальном уровне будет решена проблема создания комплексной диагностики БП на доклинической стадии путем сочетания двух упомянутых комплементарных подходов – выявления относительно специфичных биомаркеров в плазме и провокационного фармакологического теста.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Разработка доклинической диагностики БП, созданная на основе трансляционной персонализированной и профилактической медицины, будет мощным стимулом для создания доклинической диагностики других фатальных хронических нейродегенеративных заболеваний, в первую очередь болезни Альцгеймера. Более того, появление доклинической диагностики БП откроет новое направление в фармакологии – поиск лекарственных веществ с нейропротекторными свойствами, эффективных именно на ранней стадии развития заболевания.
Наряду с широко используемой в мире методологией создания комплексной доклинической диагностики нейродегенеративных заболеваний на основе анализа клинических предвестников и поиска относительно специфичных периферических биомаркеров, впервые для диагностики неврологических и психических заболеваний будет использована оригинальная технология, предложенная авторами проекта. В основе этой технологии лежит использование провокационного теста, который позволит обратимо усилить скрытую функциональную недостаточность специфической регуляторной системы мозга до такой степени, что она проявится на короткое время в виде специфических клинических симптомов. Эта методология, широко используемая в других областях медицины, позволит резко сократить временные и финансовые затраты на постановку диагноза у больного на доклинической стадии развития заболевания.
Разработка доклинической диагностики при БП позволит продлить период бессимптомного течения заболевания, т.е. комфортной жизни больного неограниченно долго, возможно, до смерти, вызванной другой причиной. В этом случае будут многократно сокращены расходы на лечение и реабилитацию этих больных.
Создание доклинической диагностики БП и вообще нейродегенеративных заболеваний является глобальной проблемой, стоящей перед человечеством, что обусловливает необходимость широкого международного научного сотрудничества для ее решения. Действительно, для решения этой задачи созданы большие национальные и международные консорциумы, и встает вопрос о создании общей базы данных результатов проведенных исследований в этом направлении (“big data” ). Кроме того, описанные выше методологии создания доклинической диагностики БП и других нейродегенеративных заболеваний позволят только создать «группы риска», в пределах которых окончательный диагноз может быть поставлен только с помощью позитронно-эмиссионной томографии – ключевого неинвазивного нейровизулизационного метода исследования мозга. Очевидно, что разработка доклинической диагностики послужит триггером для совершенствования этого метода и создания большого числа Центров нейровизуализации работы мозга.
Области применения, способы использования ожидаемых результатов:
1) Созданная в рамках проекта хроническая модель доклинической стадии болезни Паркинсона (БП) может быть использована для изучения: (а) клеточных и молекулярных механизмов наиболее ранних проявлений дегенерации нигростриатных дофаминергических (ДА-ергических) нейронов, в первую очередь деградации синаптических терминалей аксонов, (б) клеточных и молекулярных механизмов пластичности мозга, способствующей компенсации функциональной недостаточности нигростриатной системы; (б) хронологии деградации центров мозга за пределами нигростриатной и периферической нервной системы; (в) поиска легко доступных для выявления с помощью неинвазивных или малоинвазивных методов периферических биомаркеров раннего развитии заболевания; (г) селекция антагонистов ДА обратимого действия для использования в качестве провокационного теста на функциональную недостаточность нигростриатной ДА-ергической системы.
2) Созданная в рамках проекта хроническая модель клинической стадии БП может быть использована: (а) для поиска триггеров нарушения моторного поведения, т.е. перехода паркинсонизма из досимптомной стадии в симптомную путем сравнения функционального состояния нигростриатной системы на обеих стадиях; (б) в качестве тест-системы для поиска потенциальных лекарственных веществ, останавливающих или замедляющих гибель нейронов, а также стимулирующих компенсаторные процессы..
3) Экспериментальная разработка комплексной диагностики паркинсонизма на досимптомной стадии путем использования комплементарных подходов – поиска биомаркеров плазмы крови и фармакологического провокационного теста, могут служить основной для разработки доклинической диагностики БП у больных в неврологической клинике.
Результаты и модели полученные в рамках выполнения проекта могут быть использованы:
а) как новый подход в фундаментальных исследованиях к комплексной оценке молекулярных механизмов нейродегенерции и пластичности мозга;
б) в фармакологии для скрининга лекарственных веществ, в первую очередь веществ с нейропротекторными свойствами;
в) в неврологии для разработки комплексной диагностики БП на доклинической стадии.

Текущие результаты проекта:
В рамках отчетного периода были разработаны модели доклинической стадии болезни Паркинсона (БП), путем введения 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) в дозе 12 мг/кг раз в неделю в течение 5 и 7 недель. Такое введение, позволяет воспроизводить медленную импульсную дегенерацию дофаминергических (ДА-ергических) нейронов, т.к. по литературным данным известно, что дегенерация нейронов после введения МФТП заканчивается к 5 дню. При этом компенсаторные процессы не успевают «развиться» на столько, чтобы нивелировать возникшую функциональную недостаточность ДА-ергических нейронов нигростриатной системы, как и в случае БП.
В рамках этого этапа проекта при разработке досимптомной стадии БП на мышах в первую очередь была дана оценка показателей двигательной активности животных через неделю после последней инъекций МФТП, а также более детально охарактеризовано состояние нигростриатной системы по уровню моноаминов в стриатуме и черной субстанции (ЧС). Изменений в двигательной активности по всем оцениваемым показателям (пройденный путь, число стоек, время без движения и длина шага) у опытных животных по сравнению с контрольной группой (0,9% NaCl) не было обнаружено. При этом были обнаружены метаболические изменения в нигростриатной системе. В стриатуме после введения МФТП в течение 5 недель концентрация ДА была снижена примерно на 50% по сравнению с контролем и на 70% при введении в течение 7 недель. Таким образом, введение МФТП в течение 5 и 7 недель позволяет моделировать досимптомную стадию БП, что подтверждается двумя показателями: отсутствием нарушения поведения и снижением ДА, не достигая порогового уровня. Полученные данные позволяют предположить, что эти модели воспроизводят раннюю и позднюю досимптомные стадии БП, что будет проверено на следующем этапе выполнения проекта по оценке количества тел и терминалей аксонов ДА-ергических нейронов в ЧС и стриатуме, соответственно.
На полученных моделях помимо уровня ДА в стриатуме оценивали концентрацию его основных метаболитов – ДОФУК и ГВК, а также показатель «оборота» ДА по отношению метаболит/нейротрансмиттер. При этом было показано, что при введении МФТП в течение 5 и 7 недель уровень ДОФУК и ГВК снижен в той же степени, что и ДА, а отношение «оборота» ДА повышено по сравнению с контролем при введении МФТП в течение 7 недель. Эти данные свидетельствует об усилении ДА-ой нейротрансмиссии.
В ЧС изменение содержания ДА и ДОФУК было обнаружено только при пятинедельном введении МФТП, без изменений в других показателях. При введении МФТП в течение 7 недель изменений в метаболизме ДА в ЧС не было обнаружено. Учитывая, что БП является системным заболеванием и распространяется по мозгу за пределы нигростриатной системы, в рамках этого проекта мы также оценили состояние других моноаминергических систем мозга (норадренергическая система голубого пятна, серотонинергическая система ядра шва) по иннервации их аксонов стриатума. Нами не было обнаружено изменений в концентрации серотонина в стриатуме на обеих разработанных моделях БП, в то время как норадреналин был снижен на 55% при введении МФТП в течение 5 недель и в дальнейшем восстанавливается до контрольного уровня после 7 недель инъекций. Можно предположить, что снижение норадреналина отражает процесс денервации стриатума, а дальнейшее увеличение является компенсаторным восстановлением, так называемой, неДА-ергической (норадреналиновой) нейротрансмиссии, наблюдаемой при дегенерации ДА-ергической системы.
Проведенные исследования оригинальны и не имеют аналогов в мировой литературе. Разработанные нами хронические модели доклинической стадии БП являются уникальными с точки зрения адекватности патогенезу БП у людей, что позволит в дальнейшем использовать их как биологическую тест-систему для разработки новых методов ранней диагностики БП и превентивного лечения. При этом, разработка ранней диагностики БП может осуществляться по традиционному пути – поиску периферических биомаркеров, так и с использованием инновационного подхода, разрабатываемого в нашей лаборатории – фармакологического провокационного теста.
Дальнейшая разработка, наряду с доклинической стадии БП, клинической стадии заболевания у мышей позволит провести сравнительный анализ с целью выявления молекулярных механизмов перехода доклинической стадии БП в клиническую. Эти механизмы могут служить мишенями для новых методов направленной адресной фармакотерапии, являющейся важным аспектом современной трансляционной медицины.
Полученные результаты полностью соответствуют требованиям, предъявляемым к моделированию БП на доклинической стадии – отсутствие нарушений моторного поведения у животных и снижение уровня ДА в стриатуме, но не достигающего порогового уровня.