Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка методов получения иммунобиологических препаратов на основе протективного антигена Bacillus anthracis в составе гибридных частиц бактериофагов

Докладчик: Летаров Андрей Викторович

Должность: заведующий лабораторией вирусов микроорганизмов, заведующий лабораторией

Цель проекта:
1.1 На примере протективного антигена Bacillus anthracis разработать подход по модификации антигенов, которые могут быть использованы для повышения эффективности иммунобиологических препаратов вакцинного назначения. 1.2 Создать прототип иммунобиологического препарата на основе протективного антигена B. anthracis с генно-инженерными модификациями (слияние со структурными белками бактериофагов), которые позволяют формировать вирусоподобные частицы и за счет этого направленно регулировать силу и специфичность иммунного ответа. 1.3 Изучить иммуногенность полученного антигена и оценить возможность его применения для конструирования вакцин.

Основные планируемые результаты проекта:
Планируется выполнение следующих основных работ в рамках проекта:
1. Разработка дизайна искусственного гена белка протективного антигена B. anthracis, адаптированного для экспрессии в E. coli в составе частиц бактериофагов с применением методов предсказания пространственной структуры белка.
2. Разработка дизайна искусственного гена протективного антигена B. anthracis, адаптированного для экспрессии в E. coli в составе частиц бактериофагов.
3. Создание искусственного гена протективного антигена B. anthracis и проверка аутентичности его структуры.
4. Получение экспрессионной конструкции на основе искусственного гена протективного антигена B. anthracis, адаптированного для экспрессии в E. coli.
5. Разработка дизайна искусственного слитого протективного антигена B. anthracis адаптированного для экспрессии в фаговых частицах.
6. Создание искусственного слитого гена протективного антигена B. anthracis, адаптированного для экспрессии в фаговых частицах.
7. Получение экспрессионной конструкции на основе искусственного гена искусственного слитого гена протективного антигена B. anthracis, адаптированного для экспрессии в форме фаговых частиц.
8. Выделение и биологическая характеристика новых бактериофагов, обладающих патентной чистотой, которые могут быть использованы при дальнейшем развитии разрабатываемой технологии в качестве векторов для поверхностного дисплея антигенов и/или источника генов полимеризующихся структурных белков.
9. Подбор или селекция родительских штаммов E. coli, обеспечивающих максимальный уровень продукции слитого протективного антигена B. anthracis.
10. Отработка условий культивирования рекомбинантных продуцентов на основе E. coli, обеспечивающих максимальный уровень продукции слитого протективного антигена B. anthracis в нативной форме.
11. Получение экспрессионных векторов для наработки полимеризующихся белков фагов
12. Создание гибридных белков на основе полимеризующихся структурных белков и протективного антигена B. anthracis.
13. Исследование возможности получения вирусоподобных частиц на основе созданных химерных белков и исследование их физико-химических свойств.
14. Оптимизация метода получения вирусоподобных частиц и подбор условий их очистки.
15. Отработка способа получения вирусоподобных частиц с помощью инфекции бактериофагом - помощником, обеспечивающего максимальный выход слитого белка-антигена протективного антигена B. anthracis в форме фаговых частиц.
16. Создание тест-системы для количественной оценки уровня накопления в слитого белка-антигена протективного антигена B. anthracis в рекомбинантных продуцентах на основе E. coli.
17. Создание тест-системы для количественной оценки уровня накопления в форме фаговых частиц.
18. Отработка условий получения фаговых лизатов E.coli, обеспечивающих сохранность рекомбинантного протективного антигена B. anthracis.
19. Отработка условий бесколоночной очистки фаговых частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.
20. Отработка условий гель-фильтрации фаговых частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.
21. Наработка экспериментального образца фаговых частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.
22. Экспериментальная иммунизация животных иммунобиологическим препаратом на основе фаговых частиц.
23. Оценка иммуногенности иммунобиологических препаратов in vitro в реакции бласт-трансформации лейкоцитов с оценкой результата с помощью ПЦР в реальном времени.
24. Оценка иммуногенности иммунобиологических препаратов in vivo по уровню продукции токсин-нейтрализующих антител.

Ожидаемые результаты:
Существует целый ряд технологических возможностей размещения пептидов на фаговых и фагоподобных частицах. Перечислим некоторые из них.
1) Получение слитых белков с декорирующими белками капсида. Многие фаги обладают достаточно крупными декорирующими белками, которые часто несут вариабельные иммуноглобулин-подобные домены. Так, фаг Т5, например, имеет белок pb10 с С-концевым Ig – подобным доменом. С точки зрения обеспечения патентной чистоты получаемых конструктов мы полагаем целесообразным использовать самостоятельно полученные полевые изоляты бактериофагов. В нашей коллекции имеются изоляты Т5-подобных фагов, имеющих два тандемно расположенных Ig- подобных домена. Следует отметить, что при морфогенезе частиц декорирующие белки присоединяются на поздних стадиях, что дает возможность разработать такую технологическую схему, в которой антиген-содержащий белок будет экспрессироваться in trans с плазмиды, а не кодироваться геномом фага, что обеспечит дополнительную защиту системы от несанкционированного воспроизведения. Кроме того, это позволит поставить адекватные контроли для выявления эффекта присоединения к массивной вирусной частице на иммуногенность исследуемого рекомбинантного белка.
2) Имеется возможность получения макромолекулярных комплексов структурных белков, экспрессируемых искусственно, без фаговой инфекции. Так, например, белки чехлов сократимых хвостов фагов эффективно образуют поличехлы (Poglazov et al. 1999), которые могут быть использованы в качестве носителей антигенов. Анализ доменной структуры белков сократимых чехлов (см. обзор Leiman and Shneider 2012) позволяет идентифицировать домены, которые могут быть заменены на достаточно крупные (100 -300 а.к.) гетерологичные домены без потери способности к полимеризации. Использование данной схемы позволяет отказаться от использования фаговой инфекции в производственных ферментерах, что существенно упрощает производство, а также, если необходимо, подобрать условия обработки поличехлов in vitro, с целью получения необходимого распределения частиц по длине. По существующим данным макромолекулярные комплексы оптимальных размеров обеспечивают значительно более эффективное развитие иммунного ответа, чем препараты индивидуальных белков. В этой схеме гетерологичный домен будет фланкирован собственными доменами белка – носителя, что может быть важно для обеспечения его надлежащего фолдинга и, соответственно, более эффективного использования конформационных эпитопов для развития иммунного ответа. Получаемые таким образом вирусподобные частицы имеют менее стандартные размеры и часто менее стабильны, чем жизнеспособные частицы генетически модифицированных бактериофагов, но в то же время они обеспечивают значительно большую эффективность включения антигена и в процессе производства мало отличаются от стандартного производства рекомбинантных белков в клетках E. coli. .

3) Кроме вышеперечисленных возможностей могут быть использованы и другие подходы: размещение антигенных белков внутри фагового капсида с использованием сигналов упаковки внутренних белков (в этом случае первичное взаимодействие с антиген-презентирующими клетками будет полностью опосредовано фаговыми белками), создание конструктов на основе самособирающихся белков головок типа белка фага HK97, использование в качестве векторов фибриллярных белков фаговых частиц и др.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
В настоящее время существует необходимость в создании вакцины против сибирской язвы для крупного рогатого скота и северного оленя, производство которой будет экономически эффективным и безопасным, при этом выработка иммунного ответа будет обеспечивать пожизненный иммунитет привитых животных. Вакцина, адаптированная для использования в отдаленных и труднодоступных районах РФ, в частности, на Крайнем Севере, должна обладать повышенным сроком хранения без утраты иммуногенной активности.
Помимо этого, для снижения себестоимости производства, предотвращения риска заражения людей и животных производственными штаммами желательно использовать полностью безопасные микроорганизмы, трансформация которых генетическими конструкциями, несущими гены ключевых антигенов B. anthracis, позволит получить высокоэффективную субъединичную рекомбинантную вакцину против сибирской язвы сельскохозяйственным животным.
Планируемые к разработке в рамках проекта способы получения комплексных препаратов, в частности, разработанная технологическая документация (лабораторный регламент) на изготовление экспериментального образца комплексной вакцины, позволят перейти к стадии доклинических испытаний разработки.
Основным типом потребителя разработки представляются крупные и средние биофабрики, обладающие опытом производства и испытания вакцин против особо опасных инфекций и дистрибьютерской сетью. Примерами таких предприятий могут служить ФКП «Щелковский биокомбинат» и ФГУП «Орловская биофабрика». Помимо этого, производство вакцины может быть организовано на мощностях небольших компаний биотехнологического профиля, обладающих мощностями про производству сухой стерильной биомассы и имеющих сертификаты и лицензии на производство парентеральных лечебных препаратов ветеринарного назначения.

Текущие результаты проекта:
На момент регистрации Соглашение не подписано. В виду сжатых срокой начаты работы, предусмотренные первым этапом КП.