Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка и подготовка промышленного выпуска амперометрического биосенсорного анализатора для экспресс-определения биохимического потребления кислорода.

Докладчик: Алферов Валерий Анатольевич

Должность: Генеральный директор

Цель проекта:
Целью проекта является: получение значимых научных результатов и решение комплекса научно-практических задач, позволяющих создать и в короткий срок вывести на рынок новый вид научно-технической продукции – биосенсорный анализатор для экспресс-определения биохимического потребления кислорода. Основной идеологической задачей проекта является соединение знаний, опыта, имеющегося научного задела и интеллектуальной собственности коллектива исследователей Тульского государственного университета и опыта разработки и организации промышленного выпуска приборов аналогичного назначения коллектива сотрудников ООО «Эконикс-Эксперт». Главной научно-технической задачей проекта является разработка экспериментального образца нового аналитического прибора, предназначенного для экспресс-определения биохимического потребления кислорода в поверхностных пресных, подземных, питьевых и сточных водах. Реализация проекта позволит сократить срок коммерциализации результата до 1,5 – 2 лет, необходимых для проведения сравнительно несложных опытно-технологических работ.

Основные планируемые результаты проекта:
В данном проекте предлагается разработка аналитического прибора нового поколения, предназначенного для экспресс-оценки индекса БПК. Принципиальным отличием метода анализа с использованием разрабатываемого прибора от существующего является сокращение времени анализа от 5 суток до 5 - 15 мин. С помощью данного анализатора возможно осуществлять анализ в режиме реального времени, для измерения не требуется привлечения высокоспециализированного персонала. Прибор может использоваться как в стационарных условиях, так и в составе подвижных лабораторий.
В разрабатываемом биосенсоре для экспресс-определения БПК будет содержатся ряд новых элементов, представляющих научную новизну авторов проекта. К ним относятся:
• используемые штаммы микроорганизмов и их ассоциации (возможен подбор микроорганизмов, которые обеспечивали бы наиболее эффективную детекцию БПК в соответствии с типом сточных вод);
• способы формирования рецепторного элемента, обеспечивающие длительное время непрерывного функционирования анализатора (возможен выбор способа иммобилизации микроорганизмов, обеспечивающего необходимые характеристики биосенсора в соответствии с типом сточных вод);
Разработанная сенсорная база обеспечит эффективное применение аналитической аппаратуры в Российской Федерации. Следует отметить, что ее использование в полном масштабе, необходимом для решения практических задач, невозможно реализовать за счет зарубежных закупок. Так стоимость одной из самых популярных моделей БПК биосенсоров «BOD-3300» (Central Kagaku Corp., Япония) составляет более 80 000 доларов США, планируемая стоимость анализатора, разрабатываемого в проекте около 3000 долларов США. Однако основное ограничение в данном случае будет представлено высоким объемом расходных материалов (биологических рецепторных элементов) и необходимостью создания собственной аппаратуры и оборудования, которые могут обеспечить экологическую и технологическую безопасность страны.
В России аналогичные анализаторы в настоящее время промышленно не выпускаются. Стоимость БПК-биосенсоров зарубежного производства на порядок превышает стоимость анализаторов, предлагаемых в проекте. Еще одним конкурентным преимуществом разрабатываемого аналитического оборудования является сложность регулярного приобретения расходных материалов (биорецепторов) для закупленного оборудования за рубежом. Разработка собственной технологии РФ и производство аналитической аппаратуры данного класса представляется намного более предпочтительным и диктуется в том числе соображениями экологической и технологической безопасности страны.
Достижение поставленных задач будет достигнуто за счет применения уникальных штаммов микроорганизмов из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН, современных методов исследования, новой аппаратуре, имеющей высокую точность измерения.
Экспериментальные исследования будут проведены на уникальном оборудовании, которое разработано авторами данной заявки. Высокочувствительный электрохимический метод регистрации окислительной активности биологического материала основан на компьютерной обработке сигналов и позволяет производить высокоточные измерения в наноамперном диапазоне токов, что дает возможность исследовать свойства микрограммовых количеств биомассы.
Использование уникальных, запатентованных авторами проекта, методов иммобилизации микроорганизмов (патент РФ № 2461625 от 30.12.2010, патент РФ № 2492236 от 5.06.2012) позволит повысить характеристики разрабатываемых приборов и снизить их стоимость по сравнению с зарубежными аналогами. Использование различных штаммов микроорганизмов и способов их иммобилизации позволяет добиться желаемых характеристик биосенсорного анализатора в соответствии с типом анализируемого образца

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Разработанные в ходе выполнения проекта анализаторы нового поколения могут использоваться для выполнения ежедневных текущих анализов проб воды на предприятиях системы водоочистки РФ, Станциями санитарно-эпидемиологического контроля, службами МЧС, МинПрироды, экологическими структурами и биотехнологическими предприятиями.
Широкомасштабное использование разрабатываемого анализатора приведет к существенному сокращению времени химического анализа сточных, природных и поверхностных вод, что в свою очередь повысит экономическую эффективность служб и организаций занимающихся контролем состояния водных ресурсов. Использование современного физико-химического метода анализа вместо морально устаревшего классического химического метода анализа БПК позволит повысить уровень автоматизации анализа, в том числе путем встраивания разрабатываемых анализаторов в состав технологического оборудования для контроля качества сточных вод очистных сооружений на предприятиях. Последнее, в свою очередь, избавит от необходимости постоянного отбора проб и даст возможность проводить «он-лайн» мониторинг.
Долгосрочный социально-экономический эффект от применения разрабатываемой продукции будет заключатся в улучшении экологической ситуации в стране. Использование простого и надежного экспресс-метода контроля содержания загрязняющих органических веществ в воде позволит быстро определять экологически-опасные ситуации реагировать на них.

Текущие результаты проекта:
Проведен аналитический обзор информационных источников. Как следует из представленных в обзоре данных, биосенсорная детекция БПК является достаточно развитым направлением аналитической биотехнологии. Биосенсорные анализаторы БПК представляют собой надежные аналитические инструменты и с успехом используются для контроля водных экосистем наряду с традиционными методами определения БПК. Однако, следует отметить, что несмотря на полученные зарубежными исследователями положительные результаты, поиск новых решений, обеспечивающих более выcокую точность оценки индекса БПК, оперативность и воспроизводимость анализа, продолжаются. Актуальным направлением применения биосенсоров является анализ интегральных характеристик водных сред. В Российской Федерации отсутствует опыт промышленного выпуска анализаторов этого типа, а исследования по данной проблеме начали проводиться сравнительно недавно и не продемонстрировали существенных успехов. Таким образом, актуальным представляется проведение комплекса научно-технических исследований, направленных на разработку экспериментального образца амперометрического биосенсорного анализатора для экспресс-определения биохимического потребления кислорода.
Произведен выбор эффективных биокатализаторов из широкого набора микроорганизмов (родов Pichia, Candida, Debaryomyces, Arxula, Saccharomyces и Gluconobacter) по спектру окисляемых субстратов. Оценка субстратной специфичности клеток Pichia angusta, Candida baidini, Candida maltosa, Candida blankii, Debaryamyces hansenii (3 штамма), Arxula adeninovorans (2 штамма), Saccharomyces pasterianus и Gluconobacter oxydans была проведена по 12 различным субстратам. В качестве субстратов были выбраны легко окисляемые органические вещества, наиболее часто встречающиеся в стоках различных производств. Выявлено, что сенсор на основе иммобилизованных микроорганизмов Debaryamyces hansenii BKM Y-2482 способен окислять все исследуемые органические соединения. Ценным с практической точки зрения является факт наличия ответов на ДДС натрия и ДДБС натрия (компонент моющих средств), а также отсутствие токсического действия данных субстратов на клетки в составе биорецептора. Сенсор на основе дрожжей Arxula adeninovorans BKM Y-2677 наиболее активен по отношению к спиртам с неразветвленной углеродной цепью и глюкозе; наименее предпочтительными для него субстратами из числа протестированных являются аминокислоты и ПАВ. Вместе с тем клетки Arxula adeninovorans способны окислять достаточно широкий круг субстратов и являются перспективными с точки зрения возможности их использования для оценки БПК при анализе коммунальных сточных вод. Остальные исследуемые микроорганизмы окисляют более узкий спектр субстратов и менее перспективны для использования в БПК-биосенсоре.
Произведен выбор эффективных биокатализаторов из широкого набора микроорганизмов по устойчивости при иммобилизации на электроде. Характеристикой устойчивости микроорганизмов при иммобилизации является долговременная стабильность, которая характеризует устойчивость работы сенсора в течение длительного периода времени. Показано, что лучшей долговременной стабильностью обладает биосенсор на основе микроорганизмов Debaryamyces hansenii (42 суток). Дрожжевые микроорганизмы Pichia angusta, Arxula adeninovorans и Saccharomyces pasterianus так же показывают удовлетворительные результаты по стабильности (26, 32 и 23 суток соответственно) и могут быть эффективно использованы для разработки БПК-биосенсора.
Произведено изучение возможности использования скрин-принт электродов для определения БПК. В качестве модельных микроорганизмов были использованы уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans sbsp. industrius B-1280, которые обладают уникальной организацией метаболической системы, характеризующейся поверхностной локализацией ряда основных окислительных ферментов и высокой оперативностью электрон-транспортной цепи, что обеспечивает быстрый ответ биосенсора. В качестве медиаторов электронного транспорта были выбраны соединения ферроценового ряда, так как в окислительно-восстановительных системах этих соединений электронный обмен между окисленной и востановленной формами протекает очень быстро. Полученные модифицированные печатные электроды с позволяют проводить определение БПК в диапазоне 11 – 180 мг O2/л. Для апробации печатных электродов, модифицированных бактериями G. oxydans и медиатором ферроценом были использованы бродильные массы, отобранные на разных стадиях процессах брожения, имитирующие состав сточных вод бродильных производств. Полученные значения совпадают со значениями, полученными референтным методом.