Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка генетической системы для ускоренного конструирования вакцинных штаммов вируса гриппа на основе холодоадаптированного реципиента А/Краснодар/101/35/59 (H2N2)

Докладчик: Маркушин Станислав Георгиевич

Должность: Заведующий лабораторией

Цель проекта:
Создание генетической системы в виде набора из восьми плазмид – производных двухпромоторного вектора, содержащих клонированные кДНК всех сегментов холодоадаптированного реципиента А/Краснодар/101/35/59 (H2N2), и метода ускоренного получения с их использованием аттенуированных вакцинных штаммов вируса гриппа, несущих ключевые иммунологические детерминанты актуальных изолятов.

Основные планируемые результаты проекта:
Основным результатом разработки станет метод, позволяющий в максимально сжатые сроки, адекватные времени развития эпидемической или пандемической вспышки гриппа, получать живые аттенуированные вакцинные штаммы, идентичные по серологическим свойствам актуальному штамму вируса, вызвавшего вспышку. В этом отношении метод «обратной генетики», основанный на экспрессии в клетках млекопитающих или куриных эмбрионах клонированной кДНК сегментов вируса гриппа, обладает очевидным преимуществом перед традиционным методом получения реассортантов методом кокультивирования актуального штамма вируса с холодоадаптированным реципиентом с последующей селекцией потомства в условиях культивирования при пониженной температуре под давлением антител к поверхностным белкам штамма-реципиента. Несмотря на наличие в России большого опыта в реализации этой схемы, она занимает длительное время и, как правило, не позволяет своевременно получать необходимые объемы вакцины для массовой иммунизации населения против актуального эпидемического штамма. В результате в России доминирует инактивированная вакцина Гриппол, а живые аттенуированные вакцины применяются в незначительных масштабах. В первую очередь, такое положение объясняется наличием у аттенуированных вакцин реактогенности (остаточной патогенности), вызывающей легкую форму заболевания у привитых. В результате, при относительно благоприятной эпидемической обстановке по гриппу, наблюдающейся в последние 10 лет, аттенуированные вакцины вызывают отторжение как у пациентов, так и у врачей, опасающихся претензий со стороны пациентов. Между тем, в случае возникновения крупных эпидемических вспышек гриппа и, особенно, пандемий, использование инактивированных вакцин не в состоянии обеспечить создание эффективного коллективного иммунитета. Использование только этого типа вакцин неизбежно приведёт к массовой заболеваемости и, возможно, смертности, в том числе, у привитых лиц. Использование новой технологии на основе обратной генетики, уже подтвердившей свою практическую эффективность себя в США, является наиболее эффективным путем подготовки аттенуированных вакцин на случай возникновения.
Основным результатом реализации НИР в рамках заявляемого проекта является создание отечественной, конкурентоспособной и полностью патентно чистой технологии ускоренного изготовления аттенуированных вакцин на базе отечественного реципиентного холодоадаптированного штамма А/Краснодар/101/35/59 (H2N2). Этот штамм, отобранный и испытанный заявителями настоящего проекта, обладает более высокой генетической стабильностью, чем штамм А/Ленинград/134/17/57, что делает его наиболее привлекательным в качестве источника генетического материала для создания штаммов методом обратной генетики.
В ходе проекта будет создана оригинальная отечественная двухпромоторная плазмидная система, альтернативная системе на основе вектора pHW2000. Будет проведена отработка методики ускоренного клонирования кДНК актуальных изолятов в новый вектор и проведены испытания экспериментальных образцов штаммов, полученных с её помощью.
В ходе работы в процессе тестирования реассортантов штамма А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) с актуальными эпидемически опасными изолятами вируса гриппа будут получены новые данные об особенностях физиологического действия мутаций штамма-реципиента, приводящих к его аттенуации, в том числе, в генах NS, PA, PB1, PB2.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Новая технология по окончании доклинических и клинических испытаний будет непосредственно применена для конструирования живых аттенуированных вакцин. В качестве основного потребителя разработки, обеспечивающего её массовое применение, рассматривается ООО «Форт» (Рязанская область). Кроме того, она может быть передана в эксплуатацию другим заинтересованным фирмам-производителям вакцин: ФГУП «НПО Микроген», ФГУП ПИВЭ им. М.П. Чумакова РАМН и другими.
Необходимо отметить, что принцип применения разработки не предполагает наработки больших партий вакцины впрок, так как не существует возможности предугадать серотип актуального эпидемического штамма вируса гриппа до начала эпидемической вспышки. Изготовление вакцинного штамма и, тем более, готовых вакцинных препаратов на его основе, каждый раз будет начинаться после изоляции и идентификации актуального штамма. Поэтому передача разработки в эксплуатацию требует заблаговременной отработки ускоренного режим выполнения всех стадий получения штамма как на лабораторной, так и на производственной стадии.

Текущие результаты проекта:
За отчетный период достигнуты следующие наиболее значимые в научном и технологическом отношении результаты:
1. Получен набор из 8 плазмид на базе вектора pHW2000, содержащих кДНК всех сегментов генома вирусного штамма А/Краснодар/101/35/59.
2. Разработана оригинальная методика трансфекции. С ее помощью впервые показана принципиальная возможность получения жизнеспособного вирусного штамма путем экспрессии суммы плазмид на смешанной клеточной линий 293T/MDCK.
3. Показана возможность получения реассортантов, несущих неструктурные гены штамма А/Краснодар/101/35/59 и вирулентного штамма A/WSN/33(H1N1) с применением метода обратной генетики. Подтвержден ca и ts фенотип полученных реассортантов.
4. Разработан новый вектор, функционально заменяющий pHW2000.
5. Получены экспериментальные образцы аттенуированных вирусных штаммов, сконструированных с применением технологии обратной генетики.