Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка технологии послеоперационного мониторинга метастатического опухолевого роста путем анализа неклеточной свободно циркулирующей ДНК крови

Докладчик: Попов Василий Николаевич

Должность: Проректор по научной работе и информатизаци, Проректор по научной работе и информатизаци, проректор

Цель проекта:
Цели выполнения работы является разработка методических подходов для персонифицированной ранней диагностики образования метастазов первичной опухоли и создание технологии производства индивидуального диагностического теста для максимально доступного, экономически приемлемого и неинвазивного мониторинга развития метастазов опухоли на основе анализа неклеточной свободно циркулирующей ДНК крови пациента.

Основные планируемые результаты проекта:
Основной задачей данного исследования является разработка принципов создания персонифицированных диагностических наборов для послеоперационного мониторинга развития метастазов первичной опухоли у онкологических больных с использованием технологий секвенирования нового поколения и анализа неклеточной свободно-циркулирующей ДНК крови (сцДНК) как основного биомаркера.
Для этого необходимо решить несколько подзадач:
1. Разработать способ выделения сцДНК крови, позволяющий минимизировать загрязнение клеточным генетическим материалом, при сохранении количества и качества полученного материала.
2. Разработать методологические принципы и информационные аналитические инструменты для обработки данных секвенирования опухоли, позволяющие с высокой степенью надежности идентифицировать соматические мутации ДНК характерные для исследуемой опухоли.
3. Разработать алгоритмические процедуры и программное обеспечение позволяющее в автоматическом режиме выявить соматические мутации наиболее характерные для исследуемой опухоли и оптимальные с точки зрения дизайна праймеров для количественной ПЦР, а также осуществить дизайн этих праймеров.
4. Выработать рекомендации для практического применения разработанной тест-системы.
Предполагаемый ход исследования включает следующие этапы:
1.Получение и анализ ДНК опухолевой ткани методом секвенирования нового поколения и идентификация характерных мутаций, т.е. мутаций с частотой встречаемости близкой к 50%.
2.Дизайн персонифицированных праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР), специфических к идентифицированным мутациям.
3.Послеоперационный мониторинг содержания мутированных аллелей характерных для данной опухоли в сцДНК крови пациента методом количественной ПЦР.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Конечным результатом исследования станет алгоритм действий, направленный на создание персонифицированной тест-системы для диагностики метастазирования и/или рецидива заболевания у онкологических больных после операции по удалению основной опухоли. С помощью этого набора станет возможным ранняя, до клинической манифестации, диагностика начала метастазирования (рецидива) с высокой степенью точности и надежности. Эта информация позволит врачу принять своевременное решение о назначение дополнительных лечебно-диагностических процедур, что может быть критическим для жизни пациента. Определение наличия метастазов данным способом обладает более высокой предсказательной силой, чем используемые в лабораторной диагностике белковые онкомаркеры, а так же различные способы визуализации опухоли, поскольку опирается на новейшие подходы в молекулярной
диагностике, и носит персонифицированный, индивидуальный для каждого пациента характер.
Областью применения разрабатываемого продукта является клиническая молекулярная диагностика.

Текущие результаты проекта:
Для секвенирования исходного образца (опухоли) использован секвенатор производства фирмы Life Technologie (США) Ion Torrent PGM и набор праймеров HotSpot Cancer Panel для целевого ресеквенирования кодирующих последовательностей (экзонов) наиболее значимых онкогенов и первичного анализа генетического материала опухоли. Последовательности ДНК из опухолевого образца сравниваютcя с ДНК из здоровой ткани для установления индивидуального профиля соматических перестроек, характерных только для данного пациента и данной опухоли. Далее нами будет разрабатываться персонифицированный набор праймеров (около10 пар) для проведения количественной полимеразной цепной реакции для определения концентрации опухолевой ДНК, т.е. фрагментов ДНК несущих характеристические мутации в неклеточной свободно циркулирующей ДНК крови. Выделение сцДНК является одним из критических этапов данного проекта. Для получения достоверных количественных данных мы оптимизируем существующие подходы выделения
сцДНК с целью минимизировать загрязнение сцДНК фракции генетическим материалом из ядерных клеток крови (лейко- и лимфоцитов). Нами произведено сравнение ряда коммерчески доступных наборов для выделения ДНК (как отечественных, так и зарубежных производителей) и установлен наиболее подходящий(обеспечивающий наибольшую концентрацию и целостность сцДНК с минимальным уровнем контаминации клеточной ДНК) – набор компании Zymo Research. Нами сформирована когорта первично-
оперированных пациентов, страдающих раком различной локализации, у которых будет производится мониторинг концентрации мутантных аллелей в сцДНК крови. Предполагаемая периодичность анализа – 1 раз в 2 месяца.
Первые повторные образцы отобраны 10-15 октября 2014 года. Данные тестирования будут рассмотрены и проанализированы в сочетании с данными других, более традиционных, методов обследования, а также с учетом проводимых курсов радио- и химиотерапии. Разрабатываемый продукт имеет высокую социальную значимость и, при надлежащем внедрении, может существенно изменить показатель смертности от метастазов среди онкологических больных. Послеоперационный мониторинг производится с
помощью методик, не позволяющих своевременно выявить начало метастазирования. Предлагаемая методика анализа позволит резко снизить смертность от метастазов среди больных, прошедших курс лечения, и продолжающих отслеживать состояние заболевания после операции.
Созданные в рамках данного проекта методики выделения сцДНК, а так же общая инновационная концепция персонифицированной диагностики метастазирования являются объектами интеллектуальной собственности и нуждаются в соответствующей патентной
защите ввиду своей уникальности и отсутствия аналогов как в России, так и за рубежом.