Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка экспрессионной системы на основе генов антистрессовой устойчивости дрожжей Yarrowia lipolytica

Докладчик: Дерябина Юлия Ивановна

Должность: заведующий лабораторией, старший научный сотрудник

Цель проекта:
Целью работы является детальная и систематическая оценка молекулярно-генетических механизмов антистрессовой адаптации экстремофильных дрожжей Y. lipolytica в условиях роста на кормовых ингредиентах, загрязненных гидрофобными токсикантами (в частности, рыбной и мясокостной муки с превышением ПДК по микотоксинам). На основе генов антистрессовой адаптации должна быть создана полностью устойчивая и высокоэффективная система рекомбинантной экспрессии, позволяющая создавать экономически эффективные кормовые добавки, содержащие рекомбинантные белки, повышающие продуктивность сельскохозяйственных животных или обеспечивающие их специфическую защиту от инфекций.

Основные планируемые результаты проекта:
Основные задачи проекта

1.Идентифицировать гены антистрессовой устойчивости у Y. lipolytica с применением методов протеомики в условиях утилизации грубых гидрофобных субстратов.
Пути решения поставленной задачи состоят:
1) в разработке методической базы исследования
антистрессовой адаптации Y. lipolytica в условиях промышленной ферментации на низкосортном сырье (рыбной и мясокостной муки с превышением ПДК по микотоксинам);
2) разработке и оптимизации методики получения и исследования протеомного спектра Y. lipolytica в условиях антистрессовой адаптации при промышленной ферментации на экономически доступных гидрофобных средах методом двумерного электрофореза по О’Фареллу;
3) идентификации ключевых белков, участвующих в антистрессовой адаптации Y. lipolytica, методом масс-спектроскопии MALDI-TOF.

2.Сконструировать экспрессионную систему для дрожжей Y. lipolytica на основе вновь обнаруженных генов антистрессовой устойчивости.
Пути решения поставленной задачи предусматривают: 1) выбор и клонирование генов Y. lipolytica, наиболее эффективно экспрессирующихся при культивировании дрожжей на гидрофобных субстратах; 2) конструирование на основе клонированных генов Y. lipolytica замещающей интегративной генетической системы; 3) получение на базе сконструированной интегративной системы тестерных конструкций с генами-репортёрами; 4) получение рекомбинантных штаммов Y. lipolytica, содержащих тестерные конструкции с генами-репортёрами с последующим исследованием уровня транскрипционной активности промоторов генов антистрессовой адаптации с использованием сигнала репортёрного гена в условиях культивирования Y. lipolytica на различных видах низкосортного сырья (рыбной и мясокостной муки с превышением ПДК по микотоксинам).

3.Провести испытания экспрессионной системы для Y. lipolytica на основе вновь обнаруженных генов антистрессовой устойчивости.
Пути решения заявленной задачи заключаются в: 1) конструировании банков случайных пептидов в Nконцевом положении репортёрного белка, экспрессируемого в интегративной системе с помощью промоторов генов антистрессовой адаптации с использованием сигнала репортёрного гена в условиях культивирования Y. lipolytica; 2) скрининге банка случайных пептидов на увеличение репортёрного сигнала за счёт стабилизации репортёрного белка в клетках Y. lipolytica N-концевым пептидом; 3) исследовании генетической стабильности интегративной системы в условиях культивирования Y. lipolytica на различных видах экономически доступного сырья.

Ожидаемые результаты

В результате проведенных исследований будет выполнена оценка молекулярно-генетических механизмов антистрессовой адаптации экстремофильных дрожжей Y. lipolytica в условиях утилизации грубых гидрофобных продуктов (рыбной и мясокостной муки с превышением ПДК по микотоксинам). Будут созданы рекомбинантные штаммы с высокой транскрипционной активностью промоторов индуцибельных генов антистрессовой адаптации и сконструирована эффективная генетически стабильная экспрессионная система для экстремофильных дрожжей Y. lipolytica на основе идентифицированных генов
антистрессового ответа. Будет получена и протестирована на кормовую эффективность кормовая добавка на основе дрожжей Y. lipolytica, ферментируемых на экономически доступном сырье. Будет проведено испытание на острую и субхроническую токсичность кормовой добавки на основе дрожжей Y. lipolytica, ферментируемых на экономически доступном сырье (рыбной и мясокостной муки с превышением ПДК по микотоксинам).


Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Области применения, способы использования результатов

Ожидаемые результаты можно с успехом применять в интересах фундаментальной науки в качестве рекомендаций для построения модельных систем клеточного метаболизма липидов, что может представлять интерес для биоэнергетики, сельского хозяйства, селекции с целью получения новых более продуктивных сортов масличных растений и/или создание новых штаммов промышленных микроорганизмов. Результаты заявляемой работы могут быть полезны для создания и оптимизации протоколов очистки богатых жировыми компонентами сточных вод пищевых производств (например, оливкового и пальмового масел), включающих стадию биодеградации с применением штаммов Y.
lipolytica. Научные разработки, полученные в ходе выполнения работ по проекту, позволят предложить новые технологические приемы для микробиологической обработки промышленных отходов, например, рыбоперерабатывающих отраслей, богатых трудноразлагаемыми жирами, которые могут выполнять роль экономически доступных субстратов для биотехнологического производства различных экстрасекреторных продуктов Y. lipolytica. Кроме того, объектами применения ожидаемых в ходе выполнения ПНИР результатов могут служить биоремедиация водоемов и почв от нефте- и
углеводородсодержащих загрязнений, являющихся одной из основных причин экологических катастроф как на суше, так и в водных средах.

Возможные потребители ожидаемых результатов

Потребителями разрабатываемых продуктов будут компании, специализирующиеся в области производства кормовых добавок, а также научно-исследовательские и опытно-конструкторские организации, обеспечивающие расширение их продуктового портфеля.


Текущие результаты проекта:
Результаты работы: Работа по первому промежуточному отчетному периоду целиком направлена на идентификацию генов антистрессовой устойчивости с применением методов протеомики Yarrowia lipolytica.

В течение отчетного периода работы были получены следующие результаты:
1. Оформлен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы.
2. Проведены патентные исследования в соответствии ГОСТ Р 15.011-96
3. Выполнено обоснование и выбор методов и направлений исследований, способов решения задач.
4. Разработана методическая база исследования антистрессовой адаптации Y. lipolytica в условиях культивирования на низкосортном сырье (рыбной и мясокостной муки с превышением ПДК по микотоксинам).
5. Отработана методика исследования спектра белков Y. lipolytica в условиях антистрессовой адаптации при культивировании на низкосортном сырье методом двумерного электрофореза по О’Фареллу.
6. Идентифицированы ключевые белки, участвующие в антистрессовой адаптации Y. lipolytica, методом спектроскопии MALDI-TOF.
7. Подведены итоги ПНИ по этапу. Оформлена отчетная документация.
8. Проведено материально-техническое обеспечение работ этапа.

Таким образом, на первом отчетном этапе представлены все необходимые данные об осуществленных работах, направленных в первую очередь на идентификацию генов антистрессовой устойчивости с применением методов протеомики Yarrowia lipolytica, а также представлены все необходимые методики, паспорта и другие документы, позволяющие говорить об успешном завершении данного этапа работы.