Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка генетического контроля экзоцитоза

Докладчик: Касымов Виталий Анварович

Должность: Заведующий лабораторией

Цель проекта:
Разработать систему контроля экзоцитоза, на основе модификации везикул астроцитов головного мозга, для создания нового типа терапии нейродегенеративных заболеваний. В рамках данного проекта будет разработана система контроля везикулярного транспорта астроцитов и решены следующие задачи: 1) создание генетической конструкции, на основе лентивирусных векторов, обеспечивающей контролируемую экспрессию генов семейства VAMP и VGLUT. Контроль экспрессии будет осуществляться двумя триггерными сигналами, индукция которых происходит оптически, за счет химеризации с опсиновыми белками; 2) разработка метода и создание протокола получения модифицированной первичной культуры астроцитов головного мозга крыс, осуществляющей управляемый избирательный экзоцитоз (в качестве модели секреторные соединений будут использованы глутамат и лактат); 3) проведение анализа сигнальных систем астроцитов, их общего функционального статуса при модификации астроцитов кортекса и ствола мозга у здоровых крыс in vivo, а также у животных моделей печеночной энцефалопатии; 4) разработка методических рекомендаций для дальнейшего использования разрабатываемой технологии контроля экзоцитоза в испытаниях на животных моделях нейродегенеративных заболеваний. Для решения поставленных задач будут использованы современные методы синтетической биологии, направленные на создание функциональных генетических конструкций, обеспечивающих системное изменение фенотипа клеток. Для исследования результатов модификации астроцитов будут применяться современные методы конфокальной микроскопии, в том числе, в режиме TIRF, а также технологии флуоресцентной микроскопии in vivo. Оценка состава и количества секретируемых соединений будет оцениваться с использованием метода LC-MS/MS.

Основные планируемые результаты проекта:
1) Экспериментальные образцы генетической конструкции и наборов реагентов для специфической трансфекции клеток астроглии с целью таргетного контроля внутриклеточных каскадов.
2) Программа и методики испытаний генетической конструкции и набора реагентов для специфической трансфекции клеток астроглии в культуре клеток in vitro.
3) Программа и методики испытаний экспериментальных образцов генетической конструкции и набора реагентов для специфической трансфекции клеток астроглии с целью таргетного контроля внутриклеточных каскадов.
4) Инструкция по изготовлению и контролю генетической конструкции на основе вирусного вектора для трансфекции.
5) Инструкция по изготовлению и контролю набора реагентов для специфической трансфекции астроглии.
6) Инструкция по применению генетической конструкции и набора реагентов для специфической трансфекции клеток астроглии с целью таргетного контроля внутриклеточных каскадов.
7) Рекомендации по коммерциализации результатов ПНИ, а также по использованию в дальнейших исследованиях и разработках.
8) Лабораторный протокол создания генетической конструкции на основе вирусных векторов.
9) Лабораторный протокол создания моделей культуры клеток астроглии головного мозга крыс.
10) Лабораторный протокол трансфекции астроглии in vivo.
Таким образом, в результате реализации данного проекта, будет разработана модель генной терапии, отличающаяся от существующих терапевтических подходов, прежде всего направленностью не на изменения функциональности какой-либо одной молекулярной мишени, а на модификацию одной из важнейших модулирующих систем нервной ткани.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Результаты, которые планируется получить в рамках заявляемого проекта, в дальнейшем буду использованы для создания нового типа генной терапии заболеваний, вызывающих деградацию нейронов. Особенностью данной технологии, основанной на вирусной трансфекции клеток, является возможность ее не инвазивного применения. При этом, оптимальным является применение хемогенетического контроля экспрессии, используя который, можно добиться специфичности экспрессии инкорпорированных генов в определенных зонах головного мозга. Несмотря на вышесказанное, работа имеет задельный характер и направлена на поиск способов и создание заделов для нового направления клеточной биологии – управления внутриклеточными функциональными системами.
Полученные результаты будут способствовать развитию соответствующих направлений технологической платформы «Медицина будущего»: клеточной биологии, синтетической биологии, новых систем для терапии на основе молекулярных и клеточных мишеней.

Текущие результаты проекта:
Обоснован выбор направления исследований, проанализирована научно-техническая, нормативная и методическая литература по теме проекта.
Разработана генетическая конструкция на основе вирусного вектора и синтезированных олигонуклеотидов.
Разработан лабораторный протокол создания генетической конструкции на основе вирусных векторов.
Проведены патентные исследования в соответствии с ГОСТ Р 15.011-96