Регистрация / Вход
Прислать материал

Получение рекомбинантных антигенов, содержащих антигенно-значимые фрагменты белков вируса гепатита Е

Докладчик: Зверев Виталий Васильевич

Должность: Директор ГУ НИИВС им.И.И.Мечникова РАМН, директор института, директор

Цель проекта:
1. - Получение рекомбинантных аналогов антигенов ORF2 и ORF3 ВГЕ 1-го и 3-го генотипов, циркулирующих на территории стран СНГ для разработки комплекса диагностических тест-систем в рамках выполнения инновационного проекта «Создание тест-систем для серологической диагностики гепатита Е и испытание их диагностической эффективности на клиническом материале из эндемичных и неэндемичных регионов». - Получение данных по сероэпидемиологии и эпизоотологии по острым вирусным гепатитам в регионах Российской Федерации и СНГ, определение доли гепатита Е в этиологической структуре вирусных гепатитов в регионах Российской Федерации и СНГ, создание банков биологических образцов для разработки и оценки диагностической эффективности рекомбинантных антигенов и разрабатываемых на их основе диагностических тест-систем.

Основные планируемые результаты проекта:
Задачи прикладных научных исследований и возможные пути их решения
1. Проведение сероэпидемиологического мониторинга по острым вирусным гепатитам в регионах Российской Федерации и СНГ.
Пути решения:
- анализ эпидемиологической ситуации по гепатиту Е в регионах Российской Федерации, Кыргызской Республики и Республики Беларусь с различным уровнем заболеваемости;
- анализ эпизоотической ситуации по заболеваниям печени у животных свинокомплексов, фермерских и личных подсобных хозяйств;
- определение доли ГЕ в этиологической структуре вирусных гепатитов в регионах Российской Федерации и СНГ;
- проведение эпизоотологического мониторинга заболеваемости животных гепатитом Е в животноводческих комплексах, фермерских хозяйствах и дикой фауне в Республике Беларусь.
2. Создание банка клинических образцов (крови и стула) от больных гепатитами и здоровых людей из регионов Российской Федерации и СНГ с различной заболеваемостью.
Пути решения:
- сбор и типирование с помощью коммерческих тест-систем образцов сывороток крови и фекалий здоровых и больных острыми и хроническими вирусными гепатитами людей и от клинически здоровых и больных гепатитами животных в регионах СНГ.
3. Разработка рекомбинантных аналогов антигенов ВГЕ серотипов, циркулирующих на территории России и стран СНГ.
Пути решения:
- получение образцов фекальных экстрактов для выделения РНК ВГЕ 1-го и 3-го генотипов для последующего использования в клонировании;
- расчет иммунодоминантных детерминант белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1-го и 3-го генотипов, включая протективные эпитопы. Выбор и синтез праймеров для клонирования;
- клонирование в экспрессирующих векторных системах E.coli фрагментов второй и третьей открытых рамок считывания генома ВГЕ 1-го и 3-го генотипов;
- получение биомасс рекомбинантных антигенов ORF2 и ORF3 ВГЕ 1-го и 3-го генотипов с высоким содержанием целевого продукта;
- выделение рекомбинантных антигенов;
- изучение антигенных свойств полученных рекомбинантных антигенов.
Новизна выбранного способа решения поставленной задачи заключается в использовании для клонирования клинического материала от инфицированных ВГЕ людей и животных из регионов СНГ. Полученные при выполнении проекта рекомбинантные антигены ORF2 и ORF3 ВГЕ 1-го и 3-го генотипов будут специфичны для регионов СНГ и смогут быть использованы для разработки и совершенствования тест-систем для серодиагностики ГЕ на разных стадиях заболевания и проведения эпидемиологических исследований в данных регионах и на других территориях циркуляции ВГЕ данных генотипов. Наличие антигенных детерминант ВГЕ 1-го и 3-го генотипов в составе разрабатываемых полипептидов позволит создавать на их основе тест-системы как для дифференциального выявления антител к этим разновидностям возбудителя, так и для скрининговых унифицированных исследований.
Разработка рекомбинантных полипептидов с новыми антигенными свойствами может осуществить возможность получения результата, способного к правовой охране.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Описание областей применения планируемых результатов, Описание практического внедрения планируемых результатов или перспектив их использования.
В работе планируется получить рекомбинантные антигены ORF2 и ORF3 ВГЕ 1-го и 3-го генотипов для последующего использования в разработке комплекса из пяти взаимодополняющих тест-систем для выявления антител к ВГЕ:
- тест-система для выявления IgM-антител к ВГЕ «ловушечным» методом ИФА, который является наиболее чувствительным и надёжным;
- тест-система для выявления инзкоавидных IgG-антител к ВГЕ, являющихся маркерами первичного инфицирования;
- тест-система для определения суммарных антител к ВГЕ для проведения скриниговых исследований у людей и животных;
- тест-система для количественного определения IgG-антител к ВГЕ методом непрямого ИФА для исследования динамики развития иммунного ответа и напряженности иммунитета;
- тест-система определения IgG- и IgM-антител к ВГЕ в методом линейного иммуноблоттинга для подтверждающего анализа.
3. Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие научно-технических и технологических направлений; разработка новых технических решений; на изменение структуры производства и потребления товаров и услуг в соответствующих секторах рынка и социальной сфере. Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие исследований в рамках международного сотрудничества, развитие системы демонстрации и популяризации науки, обеспечении развития материально-технической и информационной инфраструктуры.
В России и странах СНГ не производятся тест-системы для подтверждающей диагностики ГЕ методом иммуноблоттинга, количественного и полуколичественного выявления IgG-антител к ВГЕ, определения суммарных антител к ВГЕ и определения IgM-антител к ВГЕ «ловушечным» методом, для определения низкоавидных антител к ВГЕ. НПО «Диагностические системы», ЗАО «Вектор-Бест» производят основанные на методе непрямого ИФА диагностические наборы для качественного выявления IgG- и IgM-антител к ВГЕ методом непрямого ИФА.
По данным Экспертного совета при Комитете Совета Федерации по социальной политике вирусные гепатиты наносят огромный ущерб экономике страны. Экономические потери от гепатита А и острых случаев гепатитов В и С в Российской Федерации только за один год составили свыше 1,4 млрд. рублей. Удельный вес острых гепатитов неустановленной этиологии в Российской Федерации последовательно увеличивается – с 2,2 процентов в 1997 гг. до 6,7 процентов в 2008 гг. Если предположить, что гепатит Е составляет хотя бы треть случаев таких гепатитов, то нетрудно сделать заключение, что в Российской Федерации ежегодно экономический от ГЕ может составлять не менее 45 млн. руб.
Лечение гепатита импортными препаратами (швейцарского, американского и немецкого производства) обходится дорого: месячный курс стоит 1,2-1,8 тыс. долларов США. Анализы на гепатит (в столичных лабораториях) в среднем стоят от 1 до 1,5 тыс. руб.
Характерным для ГЕ является преимущественное поражение лиц молодого возраста 15-29 лет – группы, представляющей значительную часть трудоспособного населения. В ряде случаев острый гепатит Е может приводить к молниеносному гепатиту (острой печеночной недостаточности) и смерти. Беременные женщины подвергаются наибольшему риску возникновения акушерских осложнений и смерти от ГЕ, который может приводить к смерти до 40 процентов женщин на третьем триместре беременности. Неблагоприятное течение ГЕ отмечается также у больных хроническими гепатитами В и С.
Стоимость тест-систем зарубежного производства для полуколичественного и количественного выявления антител IgG и IgM к ВГЕ варьирует от 300 до 720 долларов США, например:
ELISA Kit for IgG Antibody to Hepatitis E Virus. (Innovative research, США), $495;
HEV IgM ELISA kit (Diagnostic Automation, Inc., США), $300;
Нuman hepatitis E virus IgG, HEV-IgG ELISA Kit, 96T (BIOTANG Inc.США), $550;
Нuman hepatitis E virus IgG, HEV-IgG ELISA Kit, 96T (TSZELISA США), $729;
Hepatitis E IgM (HEV IgM) (Cortez, США), $335;
Hepatitis E IgG (HEV IgG) 75 1x96 (Cortez, США), $335.
В настоящее время в России не производится коммерческих аналогов запланированных к разработке тест-систем: для количественного или полуколичественного определения IgG-антител к ВГЕ, для выявления IgM-антител ловушечным методом, для выявления антител к ВГЕ методом иммуноблоттинга, для определения авидности IgG-антител к ВГЕ и определения суммарных антител к ВГЕ.
Стоимость рекомбинантных антигенов ВГЕ, используемых при производстве наборов, составляет до 2000 долларов США за 1 мг (Alpha Diagnostic International, США). Для приготовления иммуносорбента в один набор обычно требуется около 5-10 мкг антигена стоимостью 10-20 долларов США. Средняя прогнозируемая цена разрабатываемых наборов – 200 долларов США . Затраты на производство 1 набора должны составить не более 70 долларов США (с учетом того, что в проекте запланировано получение собственных рекомбинантных антигенов ВГЕ).
Минимальное количество реализуемых наборов в странах СНГ Центральной Азии при умеренной заболеваемости острыми вирусными гепатитами может составить 6 тыс. наборов в год (1500 наборов в каждой из 4-х стран из расчета 1/3 требуемого количества наборов для верификации каждого случая острого вирусного гепатита). Предполагаемое минимальное количество наборов, реализуемых на территории Российской Федерации, может составить не менее 4000 наборов в год (диагностика острого вирусного гепатита и гепатитов неясной этиологии).



Текущие результаты проекта:
1. Подготовка аналитического обзора современной научно-технической, нормативной, методической литературы по проблеме получения и применения рекомбинантных антигенов для создания тест-систем для серодиагностики гепатита Е (ГЕ), в том числе обзор научных информационных источников: статьи в ведущих зарубежных и (или) российских научных журналах, монографии и (или) патенты) - за период 2009 – 2013 гг.
2. Анализ эпидемиологической ситуации по ГЕ в регионах Российской Федерации (РФ).
3. Расчет иммунодоминантных детерминант белков вируса гепатита Е (ВГЕ) 1-го и 3-го генотипов, включая протективные эпитопы.
4. Выбор праймеров для клонирования фрагментов генома ВГЕ 1-го и 3-го генотипов
5. Сбор образцов сывороток крови и стула от здоровых лиц и больных острым вирусным гепатитом в регионах РФ и СНГ, типирование клинических образцов с применением коммерческих тест-систем, основанных на методах иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции. Отбор клинических образцов для выделения РНК ВГЕ 1-го и 3-го генотипов для последующего использования в клонировании.