Регистрация / Вход
Прислать материал

Экспресс-идентификация чувствительности злокачественных глиом человека к онколитическим вирусам

Докладчик: Чумаков Петр Михайлович

Должность: научн. сотр., ИМБ РАН, зав. лаб.

Цель проекта:
Проект направлен на разработку технологии персонифицированной медицины, позволяющей определять чувствительность злокачественной опухоли головного мозга конкретного пациента к терапевтическому действию онколитических вирусов, тем самым позволяя производить подбор наиболее эффективного штамма онколитического вируса. Применение онколитических вирусов является перспективным направлением противоопухолевой терапии. Раковые клетки как правило приобретают повышенную чувствительность к вирусам, главным образом благодаря утрате механизмов противовирусной защиты. Онколитические вирусы разрабатываются на основе нескольких вирусных семейств и характеризуются неспособностью вызывать поражение нормальных клеток. Наиболее перспективным является разработка онколитических вирусов на основе исходно непатогенных для человека вирусных штаммов. Уничтожение опухолевых клеток в организме пациента как правило не сопровождается токсическими проявлениями. В ходе онколитической терапии происходит не только прямое уничтожение опухолевых клеток вирусами, но и значительная стимуляция противоопухолевого иммунитета, за счет чего противоопухолевое действие продолжается и после прекращения действия вируса. Дополнительным преимуществом онколитических вирусов является их способность уничтожать стволовые клетки опухоли, которые особо устойчивы к действию химиотерапевтических препаратов. Несмотря на потенциальные преимущества онколитической терапии одной из основных проблем является непредсказуемость терапевтического действия применяемого вирусного штамма поскольку опухоли могут значительно различаться по чувствительности к тому или другому онколитическому вирусу. Чувствительность обусловлена наличием на поверхности злокачественных клеток специфических рецепторов, обеспечивающих проникновение вируса, а также рядом других факторов, необходимых для репликации вируса. Задачей проекта является экспериментальное установление связи между экспрессией в конкретной опухоли определенных генных маркеров и способности клеток этой опухоли эффективно размножать определенный штамм онколитического вируса. На основе этой информации будет разработан экспресс-тест, который позволит непосредственно в ходе операции осуществлять подбор наиболее эффективного терапевтического вирусного штамма для последующего введения пациенту. В качестве модели для разработки такого теста были выбраны злокачественные опухоли головного мозга, что обусловлено, в первую очередь, исключительно негативным прогнозом течения таких заболеваний. Часто радикальное удаление опухоли головного мозга невозможно по причине угрозы развития неврологического дефицита. Применение вируса обеспечит избирательное уничтожение оставшиеся злокачественных клеток, в том числе стволовых клеток опухоли, которые часто располагаются в отдаленных от опухоли участках мозга. При выполнении проекта будут отработаны процедуры поддержания кусочков опухоли пациентов в культуре (органные культуры), которые далее будут использованы для экспериментального испытания способности опухолей пациентов поддерживать размножение отдельных онколитических вирусных штаммов. Фрагменты этих же опухолей будут использованы для анализа экспрессии ряда генов (CD155, CAR, CD55, ICAM-1, DAF, Integrin α2β1, TMPRSS2, HAT и другие), функция которых может влиять на чувствительность к применяемым онколитическим вирусам. В результате будет установлена корреляция между экспрессией отдельных генных маркеров и чувствительностью злокачественных глиом к тому или иному штамму онколитических вирусов. На основе полученной информации будет разработаны PCR-тесты для экспресс-идентификации чувствительности опухоли конкретного пациента к онколитическим вирусам, что позволит проводить выбор наиболее эффективных для данного пациента терапевтических штаммов. В качестве терапевтических штаммов будут использованы вакцинные штаммы полиовируса I, II и III типов, представители вирусов ECHO и Coxsackie, а также к онколитические варианты вируса гриппа и мышиного парамиксовируса Сендай. Таким образом, в задачи проекта входит: -проведение скрининга коллекции культур клеток злокачественных опухолей головного мозга на предмет их чувствительности к панели онколитических энтеровирусов и парамиксовирусов; -определение способности набора онколитических вирусов размножаться и вызывать онколиз ксенотрансплантатов клеток злокачественных опухолей головного мозга, имплантированных в мозг иммунодефицитных мышей; -определение способности онколитических вирусов уничтожать опухолевые стволовые клетки; -совершенствование технологии получения органных культур из опухолей головного мозга; -определение способности опухолей пациентов размножать различные штаммы онколитических вирусов в условиях органной культуры; -определение способности онколитических вирусов избирательно уничтожать опухолевые клетки пациента в органной культуре; -разработка ПЦР-теста на определение экспрессии генов, обуславливающих способность опухолевых клеток поддерживать размножение отдельных штаммов онколитических вирусов (гены, кодирующие специфических вирусные рецепторы, протеазы, необходимые для созревания вируса); -определение уровней экспрессии генов, необходимых для эффективного размножения отдельных штаммов онколитических вирусов в образцах РНК, полученных из панели культур клеток злокачественных опухолей мозга человека, а также из клинических образцов опухолей, для которых было проведено определение их чувствительности к набору онколитических вирусных штаммов; -выявление взаимосвязи между способностью культур клеток или опухоли конкретного пациента размножать онколитический вирус и экспрессионным профилем генов, ответственных за чувствительность к определенной группе вирусов; -с помощью технологии РНК-интерференции определение влияния экспрессии генов, кодирующих специфические вирусные рецепторы и мембранные протеазы на способность клеток заражаться и поддерживать репликацию онколитических вирусов; -разработка экспресс-теста на основе ПЦР, позволяющего предсказывать чувствительность опухоли конкретного пациента к тому или иному онколитическому вирусу из имеющейся панели; -разработка технологии на основе биоселекции для получения вирусных штаммов с расширенным спектром воздействия на злокачественные опухоли головного мозга; -формирование панели штаммов вирусов, предназначенных для доклинических и клинических испытаний в качестве онколитических препаратов направленных против злокачественных опухолей головного мозга.

Основные планируемые результаты проекта:
Поставленные задачи предполагается решать с помощью следующих подходов:
Определение чувствительности операционных образцов злокачественных глиом к набору онколитических штаммов вирусов будет проводится поэтапно – вначале на панели культур клеток злокачественных глиом, затем - в органных культурах, полученных дезинтеграцией образцов злокачественных глиом пациентов.
Будет оптимизирована процедура приготовления органных культур – как из свежеполученного операционного материала, так и после предварительной криоконсервации.
В качестве in vivo модели будут использованы внутримозговые ксенотрансплантаты глиомных линий человека на иммунодефицитных бестимусных мышах.
Определение способности вирусных штаммов размножаться в условиях культур клеток и органных культур будет проводиться путем заражения, последующей инкубации в культуре и титрования вирусного урожая на чувствительных культурах клеток.
Действие онколитического вируса будет определяться по измерению выживаемость глиомных клеток (ХТТ-тест), изменению динамики роста опухоли (MRT-тест), увеличению титра введенного вируса.
Анализ экспрессии генных маркеров будет проводиться с помощью ПЦР в реальном времени.
Для верификации данных по корреляции экспрессии генных маркеров и чувствительности к вирусам будут использованы модельные линии клеток с подавленной с помощью РНК-интерференции или искусственно усиленной экспрессией того или иного маркера.
Селекция вариантов вирусов, обладающих расширенным тропизмом в отношении злокачественных глиом будет проводиться путем серийных пассирований на исходно нечувствительных линиях клеток мультиформных глиобластом с последующим определением типа вирусного рецептора, к которому произошла адаптация.
Штаммы, полученные путем селекции будут всесторонне охарактеризованы и запатентованы.
Будут запатентованы диагностические тесты для определения чувствительности клеток к онколитическим вирусам.
Подход к персонифицированной диагностики чувствительности к онколитическим вирусам является оригинальным и пока не имеет аналогов в мировой практике.
Реалистичность поставленных задач подтверждается рядом исследований коллектива и существенными экспериментальными заделами.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Разрабатываемы диагностические тесты и новые онколитические вирусы с расширенным тропизмом предназначены для применения в нейроонкологических клиниках для повышения эффективности лечения пациентов с злокачественными опухолями мозга.
Практическое внедрение результатов исследований будет осуществляться после прохождения доклинических и клинических испытаний. Заинтересованность в поддержке таких испытаний высказывается НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко и индустриальным партнером – НПО Микроген.
Внедрение разрабатываемых результатов в клиническую практику откроет широкие перспективы для совершенствования эффективности лечения злокачественных глиом мозга, особенно случаев с распространенным поражением мозга, которые в настоящее время терапии не поддаются. В ходе исследований будет также укреплена материально-техническая база ИМБ РАН, что позволит осуществлять новые исследования в области разработки инновационных терапевтических средств.

Текущие результаты проекта:
На текущем начальном этапе выполнения проекта проведена теоретическая работа по выбору наиболее оптимальной стратегии исследований, осуществлен патентный поиск. Отработаны процедуры титрования и количественной оценки вирусной репродукции в культуре клеток. Отобран набор генных маркеров, подлежащих первоочередному анализу в препаратах органных культур клеток злокачественных опухолей головного мозга. Получены клоны онколитических штаммов энтеровирусов (Полиовирус 1 типа, ECHO12, Coxsackie B2, Coxsackie B5), определена их первичная структура. Отработаны принципы формирования клинической коллекции операционного биоматериала. Отработаны условия для оптимальной криопрезервации органных культур злокачественных глиом из операционного материала. Сформирована колония иммунодефицитных мышей в качестве модели для исследований in vivo. Отработана методика имплантации клеток органных культур злокачественных опухолей головного мозга в мозг иммунодефицитных мышей для последующего определения чувствительности к онколитическим вирусам. Все предусмотренные для выполнения на данном этапе работы выполняются по намеченному графику.