Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка системы генетических маркеров X-хромосомы для ДНК-идентификации в криминалистике и судебной медицине.

Докладчик: Степанов Вадим Анатольевич

Должность: зам. директора, проф., доктор биол. наук

Цель проекта:
ДНК-идентификация в криминалистике и судебной медицине основывается на анализе частоты встречаемости различных маркерных ДНК-локусов, локализованных в аутосомах, половых хромосомах (Y-хромосоме и X-хромосоме) и митохондриальной ДНК в различных биологических образцах. В настоящее время для целей ДНК-идентификации используется ряд специализированных генетических тест-систем. Наиболее используемыми являются системы, основанные на маркерах аутосом и Y-хромосомы. Каждая из этих систем имеет как ряд преимуществ, так и недостатков, которые снижают их информативность в некоторых сложных случаях. Введение в широкое использование тест-системы основанной на X-хромосомных маркерах позволит решит эту проблему. Так в случаях определения родства между отцом и дочерью, и бабушкой по отцу и внучкой маркеры X-хромосомы превосходят возможности аутосомных, в два и четыре раза соответственно, применение Y-хромосомных и маркеров мтДНК в данном случае бесполезно. Целью настоящего ПНИ является разработка тест-системы SNP-маркеров X-хромосомы для ДНК-идентификации в популяциях России и основанной на мультиплексном генотипировании методом мультиплексной ПЦР и MALDI-TOF масс-спектрометрии, а также создать базу данных референтных частот SNP-маркеров X-хромосомы для популяций России.

Основные планируемые результаты проекта:
В ходе выполнения ПНИ должны быть получены следующие научно-технические результаты:
1) Экспериментальный образец тест-системы для идентификации личности на основе SNP маркеров X-хромосомы человека для идентификации личности в криминалистике и судебной медицине.
2) Базa данных референтных частот выбранных маркеров для населения России.
3) Методика применения разработанной тест-системы на основе SNP-маркеров X-хромосомы.
4) Предложения и рекомендации по использованию разрабатываемой тест-системы в криминалистике и судебной медицине.
5) Проект технического задания на проведение ОКР по теме «Разработка системы генетических маркеров X-хромосомы для ДНК-идентификации в криминалистике и судебной медицине».
Для достижения заявленных результатов должен быть выполнены следующие работы:
- Должен быть осуществлен выбор наиболее информативных SNP-маркеров X-хромосомы для ДНК-идентификации в популяциях России.
- Из выбранных SNP-маркеров X-хромосомы должен быть осуществлен отбор SNP входящих в различные блоки сцепления для максимального повышения информативности тест-системы.
- Должен быть сформирован набор SNP-маркеров X-хромосомы для совместного мультиплексного генотипирования методом мультиплексной ПЦР и MALDI-TOF масс-спектрометрии.
- Должна быть разработана методика проведения MALDI-TOF масс-спектрометрии набора SNP-маркеров X-хромосомы.
- Должна быть разработана методика проведения мультиплексной ПЦР набора SNP-маркеров X-хромосомы.
- Должны быть разработаны требования к разрабатываемой тест-системе (технические характеристики, требования к эффективности, экономичности, воспроизводимости и т.д.), определяемые их назначением, условиями эксплуатации и применения.
- Должен быть разработан лабораторный регламент изготовления тест-системы для идентификации личности по ДНК маркерам X-хромосомы человека.
- Должны быть изготовлены экспериментальные образцы тест-системы и проведено генотипирование выбранных SNP-маркеров Х-хромосомы в популяционных выборках населения России и сопредельных стран с использованием разработанной тест-системы методом MALDI-TOF масс-спектрометрии.
- Должна быть выполнена верификация данных генотипирования образцов ДНК с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии путем секвенирования анализируемых локусов ДНК X-хромосомы в контрольной группе образцов.
- Должна быть выполнена валидация разработанной тест-системы.
- Должна быть выполнена оценка идентификационного потенциала разработанной тест-системы в популяциях России.
- Должен быть осуществлен анализ частот аллелей SNP-маркеров X-хромосомы.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Полученные результаты исследования могут быть применены в разработке систем и стандартов генетических маркеров ДНК-идентификации, разработки референтных баз данных для ДНК-тестирования и геномной регистрации. Применение возможно в области криминалистики, судебной медицины, ДНК-тестирования, разработки услуг геномной медицины. Внедрение разрабатываемой отечественной генетической тест-системы на основе мультиплексного генотипирования однонуклеотидных маркеров Х-хромосомы человека должно обеспечить использование
высокоэффективных, оптимальных по стоимости методов генетической идентификации личности. Разработанная тест-система может быть изготовлена в различных масштабах – наборами для генотипирования от нескольких десятков до нескольких сотен образцов, в зависимости от потребностей пользователя. Комплектность тест системы также может быть сформирована в различных вариантах. Одновременно с тест-системой потребителям могут поставляться Инструкции по применению тест систем, методические рекомендации по их использованию и другие сопроводительные материалы.
Разработанная в рамках настоящего проекта тест-система может быть внедрена в лабораториях ДНК-диагностики и криминалистических лабораториях. Разработанная тест-система может быть использована также в научных лабораториях в исследовательских целях (изучение генетического разнообразия популяций человека). Прикладное значение таких исследований заключается в пополнении баз данных, которые используются для расчета вероятности случайного совпадения генотипов у неродственных индивидов.
Получаемые результаты будут обладать широкими перспективами для коммерциализации и практического использования в криминалистике, судебной медицине, для идентификации личности. В России формируется обширный рынок для генетического тестирования в области криминалистики и судебной медицины. Формирование этого рынка обусловлено несколькими факторами, включая: - обширный спрос на тестирование родства; - необходимость обеспечения выполнения Федерального закона Российской Федерации от 3 декабря 2008
г. N 242-ФЗ “О государственной геномной регистрации в Российской Федерации"; - наличие сети потенциальных потребителей тест-системы, включая Экспертно-криминалистические центры в регионах РФ; учреждения судебной медицины (судебно-медицинские экспертизы); учреждения, осуществляющие медико-генетическое консультирование, в том числе определение отцовства; частные медицинские учреждения; компании, предоставляющие услуги генетического тестирования; - технологические и ценовые преимущества разрабатываемой в работе тест-системы по сравнению с зарубежными аналогами; - наличие биотехнологических и молекулярно-биологических компаний – потенциальных производителей тест-системы.

Текущие результаты проекта:
1) Аналитический обзор современной научно-технической литературы, а также анализ результатов аналогичных исследований по разработке тест-систем для ДНК-идентификации позволил установить, что оптимальным вариантом для решения поставленных перед нами задач является использование технологии MALDI-TOF масс-спектрометрии. Метод MALDI-TOFF масс-спектрометрии обладает очень высоким разрешением, что позволяет отличить сигнал детекции исследуемых образцов ДНК от неспецифического фона, в результате чего данный метод обладает очень высокой чувствительностью. Кроме того, выбранный метод также обладает и значительной призводительностью.
2) Был отобран перечень наиболее информативных SNP-локусов Х-хромосомы. Отбор маркеров проводился следующим образом: а) на основании частот встречаемости аллелей в 12 популяциях, представляющих различные коренные этносы населения России, были рассчитаны значения ожидаемой гетерозиготности для 2867 SNP-маркеров Х-хромосомы во всех популяциях, а также их средние значения для всего массива популяций; б) опираясь на среднее значение ожидаемой гетерозиготности в 12 популяциях, были отобраны наиболее информативные для ДНК-идентификации маркеры SNP-маркеров Х-хромосомы; в) далее был проведен анализ блоков сцепления SNP-маркеров вдоль всей Х-хромосомы по генетическим базам данных и, на основании информации о локализации выбранных маркеров на хромосоме, для максимального увеличения информативности тест-системы, исключены потенциально сцепленные SNP-маркеры; г) затем проводился анализ неравновесия по сцеплению для отобранных маркеров в 12 непосредственно в популяциях, представляющих различные коренные этносы населения России. Для отобранных в результате этих работ SNP-маркеров были рассчитаны значения идентификационных криминалистических показателей, а также составлена краткая характеристика каждого из маркеров.
3) Проведенный отбор информативных SNP-маркеров Х-хромосомы позволил сформировать набор, включающий 68 SNP, которые демонстрируют высокие показатели гетерозиготности и генетической дифференциации в популяциях населения России, не входят в совместные блоки сцепления и, таким образом, наиболее информативны для ДНК-идентификации. Большинство отобранных SNP-маркеров Х-хромосомы локализуется в межгенных регионах (64,3%), остальные 35,7% расположены в некодирующих белки регионах 22 различных генов. Уровень ожидаемой гетерозиготности выбранных SNP варьирует от 0,495781 до 0,492502. В результате предварительных расчетов идентификационных криминалистических показателей было показано, что мультиплексный набор из 66 SNP-маркеров Х-хромосомы существенно превышает идентификационный потенциал стандартного набора микросателлитных маркеров, применяемого для ДНК-идентификации и состоящего из 15 аутосомных STR.
4) Разработана методика проведения MALDI-TOF масс-спектрометрии набора SNP-маркеров X-хромосомы. Технология мультиплексного генотипирования с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии, используемая в настоящей работе, позволяет анализировать более 40 полиморфных маркеров геномной ДНК у 94 образцов (индивидов за одну реакцию). В основе разработанной методики мультиплексного генотипирования набора SNP-маркеров Х-хромосомы с помощью технологии MALDI-TOF масс-спектрометрии лежит анализ отличий масс продуктов амплификации альтернативных аллелей.
5) Разработана методика проведения мультиплексной ПЦР набора SNP-маркеров X-хромосомы. В рамках разработанной методики получены два мультиплексных набора для генотипированяи SNP: первый, включающий 36 SNP-маркеров Х-хромосомы и второй, содержащий 30 SNP-маркеров Х-хромосомы. Для каждого из маркеров было подобрано 2 ПЦР-праймера (прямой и обратный) и пролонгирующий праймер для iPLEX-реакции. 62% SNP, попавших в мультиплекс, локализовано в межгенных областях, 32% в интронных областях генов.
6) Разработаны требования к разрабатываемой тест-системе (технические характеристики, требования к эффективности, экономичности, воспроизводимости и т.д.), определяемые их назначением, условиями эксплуатации и применения.