Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка аналитической системы на основе суспензионных микрочипов для высокопроизводительного выявления биомаркеров онкозаболеваний.

Докладчик: Набиев Игорь Руфаилович

Должность: Зав. лабораторией, профессор, доктор химических наук

Цель проекта:
1. Разработать аналитическую систему на основе суспензионных микрочипов для высокопроизводительного выявления биомаркеров онкозаболеваний. 2. Цели выполнения ПНИ 2.1 Создать аналитическую тест-систему на основе белковых (протеомных) биомаркеров для высокочувствительной и ранней диагностики онкологических заболеваний. 2.2. Провести испытания экспериментальных образцов аналитической тест-системы на при-мерах детекции биомаркеров трех видов онкологических заболеваний (рак молочной железы, рак яичников и рак шейки матки). 2.3 Провести сравнение разработанной аналитической тест-системы с существующими со-временными ИФА методами детекции онкомаркеров, используемыми в клинической практике.

Основные планируемые результаты проекта:
1. В ходе выполнения ПНИ должны быть получены следующие научно-технические результаты:
1) Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ, содержащие:
а) анализ научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов, относящихся к разрабатываемой теме;
б) результаты анализа данных экспериментальных исследований;
в) обобщение и выводы по результатам ПНИ.
2) Отчеты о патентных исследованиях, оформленные в соответствии с ГОСТ 15.011-96.
3) Лабораторный регламент изготовления аналитической тест-системы
4) Экспериментальные образцы аналитической тест-системы для диагностики рака молочной железы, яичников и рака шейки матки, включающие:
- суспензионные чипы: популяции флуоресцентных микросфер, спектрально кодированных путем включения в их оболочку флуоресцентных полупроводниковых нано-кристаллов (отдельных типов нанокристаллов или комбинацией нанокристаллов разного цвета);
- моноклональные и/или однодоменные антитела химически связанные с поверхностью микросфер способом, обеспечивающим максимальную доступность центров связывания для реакции специфического белок-белкового взаимодействия;
- калибровочные антигены - биомаркеры онкозаболевания;
- детектирующие моноклональные антитела;
- флуоресцентно-меченные агенты, проявляющие иммунокомплексы.
5) Коллекция биологических образцов сыворотки крови больных пациентов и здоровых до-норов.
6) Методика синтеза полупроводниковых нанокристаллов.
7) Методика получения водорастворимых нанокристаллов.
8) Методика стабилизации полупроводниковых нанокристаллов в водных растворах.
9) Методика создания конструкций, кодирующих распознающие молекулы в форме одно-доменных антител, специфичных к определенному виду онкологического биомаркера.
10) Методика получения распознающих молекул в форме однодоменных антител, специ-фичных к определенному виду онкологического биомаркера.
11) Методика получения микросфер, оптически кодированных полупроводниковыми нано-кристаллами.
12) Методика конъюгации распознающих молекул со спектрально кодированными микро-сферами – формирования элементов суспензионных микрочипов.
13) Сертифицированный каталог коллекции сывороток.
14) Стандартные операционные процедуры по оценке качества флуоресцентных нанокристаллов.
15) Стандартные операционные процедуры по оценке стабильности микросфер, оптически кодированных полупроводниковыми нанокристаллами.
16) Стандартные операционные процедуры по оценке стабильности элементов суспензионных микрочипов.
17) Инструкция по применению аналитической тест-системы.
18) Лабораторный регламент изготовления аналитической тест-системы.
19) Технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального парт-нера - организации реального сектора экономики.
20) Проект технического задания на проведение ОКР по теме: «Разработка опытно-конструкторской и технологической документации для получения производственной серии тест-системы на основе суспензионных микрочипов для высокопроизводительного одновременного выявления биомаркеров онкологических заболеваний».

2. Основные характеристики планируемых результатов.
1)Аналитическая тест-система на основе техники суспензионных микрочипов должна включать:
- суспензионные микрочипы: популяции флуоресцентных микросфер, спектрально кодированных путем включения в их оболочку флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов (отдельных типов нанокристаллов или комбинацией нанокристаллов разного цвета);
- моноклональные и/или однодоменные антитела химически связанные с поверхностью микросфер способом, обеспечивающим максимальную доступность центров связыва-ния для реакции специфического белок-белкового взаимодействия;
- калибровочные антигены - биомаркеры онкозаболевания;
- детектирующие моноклональные антитела;
- флуоресцентно-меченные агенты, проявляющие иммунокомплексы.
2) Аналитическая тест-система должна обеспечивать выявление онкологических маркеров трех видов онкологических заболеваний (рак молочной железы, рак яичников и рак шейки матки) с возможностью расширения списка диагностируемых заболеваний.
3) Аналитическая тест-система должна обеспечивать количественное определение содер-жания не менее 6 онкомаркеров в сыворотке крови с возможностью увеличения числа опре-деляемых маркеров и использования иных биологических жидкостей.

3-4. Оценка элементов новизны научных (технологических) решений, сопоставление с результатами аналогичных работ.
Высокий уровень смертности, связанный с опухолевыми заболеваниями (1,7 млн. смертей в год в Западной Европе при существенно худшей статистике в Российской Федерации), во многом связан с недостаточным уровнем чувствительности существующих диагностических методов, ограничивающих возможность ранней детекции онкологических заболеваний. Исследования и разработки последних лет показали, что использование для направленной и высокоточной диагностики флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов (НК) позволяет существенно повысить как чувствительность так и специфичность анализа.
В настоящее время для диагностики практически всех известных заболеваний применяются органические флуоресцирующие красители (флуорофоры). Такие красители используются в составе систем, основанных либо на иммунофлуоресцентном анализе (для детекции биомаркеров заболеваний используются флуоресцентно-меченые антитела), либо на полимеразной цепной реакции (ПЦР) (для детекции конкретных последовательностей ДНК или РНК, характеристичных для детектируемого заболевания, используются флуоресцентно-меченые олигонуклеотиды).
Несмотря на существенные достижения в области разработки таких диагностических систем и внедрения их в клинико-лабораторную практику, специалисты всего мира отмечают целый ряд присущих им физически неразрешимых недостатков:
• Низкая фотостабильность органических флуоресцентных красителей (разрушаются при длительном возбуждении и, таким образом, не позволяют проводить накопление полезного сигнала);
• Полосы поглощения (область возможного возбуждения) и флуоресценции каждого флуорофора очень близки, что не позволяет возбуждать флуорофоры разных цветов одним и тем же источником света (осуществлять многопараметрическую детекцию многих биомаркеров онкологических заболеваний);
• Недостаточная яркость для высокочувствительной диагностики, так как органические флуорофоры не могут поглотить достаточное количество возбуждающих квантов энергии (имеют низкий коэффициент поглощения), а значит и не испускают достаточного количества фотонов флуоресценции, которые используются для детекции.
Указанные недостатки носят принципиальный, неустранимый для данного способа диагностики, характер, поэтому для существенного прогресса в этом направлении требуется разработка качественно иного подхода.
Популярной системой для многопараметрического анализа, получающей все большее распространение, являются так называемые суспензионные микрочипы - спектрально кодированные коллоидные микрочастицы, анализируемые с использованием проточных цитометров. Фирмой Luminex были разработаны суспензионные микрочипы на основе органических красителей и проточные системы для их анализа. В таких системах спектральное кодирование осуществляется двумя органическими красителями, флуоресцирующими в красном диапазоне длин волн, возбуждаемыми красным лазером. Индикация детектируемого вещества в анализируемом образце производится иммунофлуоресцентным методом: детектируемое вещество селективно связывается с поверхностью спектрально кодированной микросферы и одновременно с распознающей молекулой, конъюгированной с флуоресцентной меткой. Цвет флуоресценции метки – зеленый, для возбуждения требуется отдельный источник излучения. Таким образом, присутствие в растворе детектируемого вещества индуцирует формирование комплекса микросфера/вещество/метка, что регистрируется проточным цитометром в форме одновременного появления сигналов в зеленом и красном каналах регистрации.
Предлагаемый в данном проекте подход к созданию суспензионных микрочипов имеет принципиальное отличие от уже существующих систем за счет использования высокофлуоресцентных НК для спектрального кодирования микросфер. Разработанные заявителем проекта (защищенные европейскими и евразийскими патентами) НК более чем в тысячи раз более фотостабильны и способны поглотить в сотни раз больше возбуждающего света, чем лучшие органические флуорофоры. В результате, квантовые точки позволяют проводить длительное накопление полезного флуоресцентного сигнала при диагностике и настолько ярки, что обеспечивают их детекцию на уровне единичных объектов (или меченных ими молекул), используя рутинную биомедицинскую технику (флуоресцентный микроскоп, сканер или проточный цитометр). Кроме того, хотя НК разных размеров (от 2 до 10 нм) испускают флуоресценцию разных цветов (от синей до красной области оптического спектра), область поглощения у них одна и та же и имеет намного более широкий диапазон в сравнении с органическими флуорофорами. Таким образом, флуоресценция НК разных цветов (размеров) может быть возбуждена одной и той же длиной волны возбуждения, что открывает уникальные возможности для многопараметрической одновременной детекции множества биомаркеров заболевания. Так как флуоресценция НК возбуждается в широком диапазоне длин волн, это упрощает и удешевляет систему детекции. Принципиальным является то, что использование НК позволяет создавать тест-системы с практически неограниченным числом кодов. Препятствием на пути создания таких тест систем являются трудности, связанные с внедрением НК в полимерные матрицы и поведением НК в конденсированном состоянии. Пути решения этих проблем разработаны в наших недавних исследованиях. Методами послойного нанесения противоположно заряженных электролитов нами получены стабильные спектрально кодированные микросферы. Получены и опубликованы результаты по использованию таких систем для многопараметрической детекции онкологических биомаркеров (свободного и связанного простатического специфического антигена (PSA) – маркера рака предстательной железы) в сыворотке крови.
В рамках настоящего проекта планируется развить уже полученные фундаментальные результаты в реализации многопараметрических аналитико-диагностических систем для детекции максимально необходимого числа онкмаркеров в одном образце сыворотки крови. Опираясь на разработанные методики в настоящем проекте предлагается создание системы для одновременной количественной детекции 6 антигенов – маркеров различных патологий женской репродуктивной системы: CEA (раково-эмбриональный антиген), CA15-3, CA27-29 (специфические маркеры рака молочной железы), CA125, (маркер рака яичников), фрагмент p105 белка HER2/neu (маркер агрессивности раков молочной железы и яичников), SCCA (антиген плоскоклеточной карциномы, маркер рака шейки матки). Предлагаемая система может быть эффективно внедрена в клиническую практику для систематического скрининга и своевременной дифференциальной диагностики различных нозологических форм заболеваний женской репродуктивной системы.

5. Фундаментальной проблемой, решаемой в рамках настоящего проекта, является разработка нового подхода к высокочувствительной многопараметрической диагностике маркеров онкозаболевания в биологических жидкостях. Данный подход, позволяющий с высокой точностью одновременно детектировать несколько онкомаркеров в одном образце, что особенно важно для ранней дифференциальной диагностики заболеваний, осуществляется за счет применения последних достижений нанотехнологии, а именно, путем разработки гибридных нанобиотехнологических систем, объединяющих биологические распознающие (антитела) и полупроводниковые сигнальные (флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы, НК) элементы. Метод основан на использовании так называемых "суспензионных микрочипов" - спектрально кодированных микросфер с поверхностью которых ковалентно связаны активные распознающие биомолекулы. Основой метода регистрации специфического сигнала является взаимодействие ангиген-антитело, обеспечивающее формирование супрамолекулярного комплекса (иммунофлуоресцентный метод детекции). Основным преимуществом предлагаемого подхода перед существующими на данный момент методами детекции онкомаркеров в клинико-диагностической практике является возможность одновременного количественного определения необходимого количества маркеров онкозаболевания в одном образце биологической жидкости человека с высокой точностью ивоспроизводимостью.
Задачи работы:
- разработка лабораторных образцов тест-системы;
- изготовление и испытания аналитической тест-системы;
- подготовка технического задания на организацию производства аналитических тест-систем для высокопроизводительного, высокоточного и многопараметрического выявления биомаркеров онкологических заболеваний в сыворотка крови человека.
В настоящем проекте планируется разработка аналитико-диагностических тест-систем, изготовление экспериментальных образцов, разработка лабораторного регламента изготовления тест-систем и подготовка технического задания на проведение ОКР по организации производства аналитико-диагностических тест-систем для высокопроизводительного, высокоточного, многопараметрического и одновременного выявления биомаркеров онкологических заболеваний. Разработка включает создание диагностических наборов для высокоточной и многопараметрической ранней диагностики онкологических заболеваний на основе микрочастиц, оптически кодированных различными комбинациями флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов (НК), "квантовых точек" разных цветов, представляющими собой элементы суспензионных микрочипов для проточной цитометрии.
Основой таких аналитических тест-систем является использование принципа спектрального кодирования, т.е. маркирование каждого типа микрочастиц, несущих на себе распознающую молекулу, индивидуальным спектральным кодом (комбинацией цветов). Принципиальным отличием от известных систем является применение для спектрального кодирования полупроводниковых флуоресцентных НК, обладающих принципиальными преимуществами перед другими флуорофорами по их фотостабильности и яркости (чувствительности детекции), позволяющих реализовать наибольшее на сегодняшний день число кодов, при возбуждении единственным источником возбуждения и не требующих использования специальных компенсационных схем при анализе результатов в проточной цитометрии. Применение нового подхода позволяет существенно сократить время анализа в рутинной клинико-диагностической практике, повысить его точность, достоверность диагноза, в том числе на ранних стадиях заболевания за счет одновременной детекции необходимого для дифференциальной диагностики количества биомаркеров (принцип микрочипов).


Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Областью применения ожидаемых результатов является лабораторная клиническая диагностика онкологических заболеваний, а именно выявление на ранних стадиях развития до появления выраженных симптомов. Разрабатываемая аналитическая система на основе суспензионных микрочипов предназначена для одновременного определения 6 информативных онкомаркеров с целью эффективной дифференциальной лабораторной диагностики доброкачественных и злокачественных патологий женской репродуктивной системы (опухоли молочной железы, опухоли яичников, рак шейки матки). Предлагаемая система может быть эффективно адаптирована и внедрена в клиническую лабораторную практику для систематического скрининга населения, своевременного дифференциального диагностирования различных форм нозологических форм заболеваний и рационального выбора подходов к лечению.

2-3. Возможными потребителями результатов, полученных в ходе выполнения данного проекта, являются медицинские организации, работающие в области исследования и клинической диагностики онкологических заболеваний. Не менее важными потребителями являются организации, занимающиеся биомедицинскими и биологическими исследованиями, в частности Индустриальный партнер проекта компания «Наномультиплекс» - динамично развивающееся малое инновационное предприятие, резидент «Сколково». Деятельность компании направлена на создание и коммерциализацию качественно нового класса инструментов (наборов реагентов и аналитических приборов) для высокоточной и многопараметрической ранней диагностики онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний человека с помощью флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов.


Текущие результаты проекта:
Проанализирована научно-техническая литература с 2010 по 2014 год по методам одновременной детекции множественных онкомаркеров.
Исследована информация по существующим методам одновременной детекции множественных онкомаркаеров с использованием флуоресцентных меток, включая 10 российских и 15 международных патентов.
Разработан метод синтеза коллоидных нанокристаллов с длинной волны эмиссии флуоресценции при 520 нм и квантовым выходом достигающим 75%.
Проведены переговоры с потенциальными поставщиками оборудования и материалов, получены коммерческие предложения на закупку материалов и оборудования, идет подготовка договоров.