Регистрация / Вход
Прислать материал

Моделирование панелей молекулярно-генетических маркеров и разработка тест-систем их идентификации на основе технологий генного и геномного анализа для раннего отбора сельскохозяйственных животных по хозяйственно- и экономически значимым признакам

Докладчик: Зиновьева Наталия Анатольевна

Должность: Директор ВИЖ им. Л.К. Эрнста, Рук. Центра биотехнологии и молекулярной диагностики, академик РАН, профессор, доктор биологических наук

Цель проекта:
1.1. Целью ПНИ является моделирование панелей молекулярно-генетических маркеров и разработка макетов тест-систем их идентификации для раннего отбора сельскохозяйственных животных по хозяйственно- и экономически значимым признакам. 1.2. Данный проект направлен на методическое и методологическое обеспечение разработки и внедрения в стране технологий генетической селекции, основанных на методах генного и полногеномного анализа и адаптированных для российских популяций скота, посредством моделирования панелей молекулярно-генетических маркеров и разработки систем их идентификации для раннего отбора животных по хозяйственно- и экономически значимым признакам как основы повышения эффективности сельскохозяйственного производства.

Основные планируемые результаты проекта:
2.1. В ходе реализации проекта должны быть получены следующие результаты:
2.1.1.Перечень научных и научно-технических результатов, подлежащих получению при выполнении ПНИ, содержащие, в том числе:
а) обзор и анализ современной научно-технической, методической литературы;
б) обоснование и выбор направлений исследований;
в) изложение методик проведения исследований;
г) результаты экспериментальных исследований;
д) обобщение и выводы по результатам ПНИ.
2.1.2 Макеты тест-систем для определения молекулярно-генетических маркеров, включенных в панели "Продуктивность" и "Фертильность".
2.1.3 Лабораторные технологические регламенты получения тест-систем.
2.1.4 Стандарты организации на тест-системы.
2.1.5 Инструкций по применению разработанных макетов тест-систем.
2.1.6 Проекты ТЗ по темам:
- на выполнение ОТР по теме: "Разработка технологии генетической селекции для российской популяции крупного рогатого скота";
- на выполнение ОКР по теме: "Разработка и организация опытного производства комплекса тест-систем анализа молекулярно-генетических маркеров для решения задач племенного животноводства".
2.2.Основные характеристики планируемых результатов:
2.2.1 Должен быть выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ, в том числе обзор научных информационных источников: статьи в ведущих зарубежных и (или) российских научных журналах, монографии и (или) патенты - не менее 50 научно-информационных источников за период 2009 – 2013 гг.
2.2.2. Должны быть выполнены патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96.
2.2.3. Должны быть проведены теоретические исследования по выбору и обоснованию методических подходов идентификации маркеров для включения в разрабатываемые модели панелей "Продуктивность" (PR) и "Фертильность" (FR).
2.2.4 Должны быть определены требования к экспериментальным популяциям быков с учетом популяционно-генетических параметров экспериментальной популяции (не менее 5 показателей), с учетом показателей продуктивности дочерей, оценки по потомству и достоверности оценки племенной ценности (EBV) не менее 70% (для выборки 1).
2.2.5 Значения племенной ценности (EBV) быков-производителей по хозяйственно- и экономически-значимым признакам (не менее 5 показателей) должны быть рассчитаны с использованием модели, адаптированной для изучаемой популяции быков-производителей.
2.2.6. На основании требований к экспериментальным популяциям должны быть получены информационный и биологический материал (кровь, сперма) и для проведения экспериментальных исследований (выборка 1 - не менее, чем от 96 голов; выборка 2 - не менее, чем от 240 голов).
2.2.7. Быки экспериментальной популяции (выборка 1) должны быть генотипированы по 50 тыс. SNP с использованием биочипа Illumina BovineSNP50 BeadChip, Illumina Inc. (San Diego, CA) и микросателлитным маркерам (не менее 12).
2.2.8. Должна быть выполнена оценка чистопородности быков-производителей на основании анализа микросателлитов (не менее 12 локусов); коэффициент подобия быков производителей должен быть не ниже 0,7 (p<0,05).
2.2.9 Должны быть сформулированы требования к разрабатываемым макетам тест-систем (технические характеристики, функциональные свойства), определяемые их назначением, условиями эксплуатации.
2.2.10. Должен быть экспериментально определен спектр молекулярно-генетических маркеров для включения в разрабатываемые панели "Продуктивность" и "Фертильность".
2.2.11. Должно быть выполнено теоретическое моделирование тест-систем анализа полиморфизмов молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с хозяйственно- и экономически-значимыми признаками крупного рогатого скота голштинской черно-пестрой породы.
2.2.12. Должны быть разработаны Программы и методики исследовательских испытаний тест-систем.
2.2.13. Должны быть разработаны и изготовлены тест-системы для определения не менее 13 молекулярно-генетических маркеров и проведены их исследовательские испытания по разработанным программам и методикам испытаний для определения молекулярно-генетических маркеров, включенных в панели "Продуктивность" и "Фертильность".
2.2.14 По результатам экспериментальных исследований должны быть отобраны и изготовлены тест-системы для определения не менее 10 молекулярно-генетических маркеров и проведены их дополнительные исследовательские испытания по разработанным программам и методикам испытаний для определения молекулярно-генетических маркеров, включенных в панели "Продуктивность" и "Фертильность".
2.2.15 Должна быть изучена необходимость и возможность усовершенствования панелей молекулярно-генетических маркеров "Продуктивность" и "Фертильность" и тест-систем на их основе.
2.2.16. Должны быть разработаны лабораторные технологические регламенты получения тест-систем (для не менее 10 молекулярно-генетических маркеров).
2.2.17. Должны быть разработаны стандарты организации на тест-системы (для не менее 10 молекулярно-генетических маркеров).
2.2.18. Должны быть разработаны проекты инструкций по применению разработанных макетов тест-систем (для не менее 10 молекулярно-генетических маркеров).
2.2.19 Должны быть разработаны Проекты ТЗ по темам:
- на выполнение ОТР по теме: "Разработка технологии генетической селекции для российской популяции крупного рогатого скота"
- на выполнение ОКР по теме: "Разработка и организация опытного производства комплекса тест-систем анализа молекулярно-генетических маркеров для решения задач племенного животноводства".
2.3. Задача создания в РФ современной технологии генетической оценки крупного рогатого скота, базирующей на методах генного и геномного анализа не может быть решена простым воспроизведением существующих зарубежных технологий. Разрабатываемые в зарубежных лабораториях технологии оценки генотипа не могут быть эффективно использованы в РФ (а, в некоторых случаях, напротив, могут оказать негативное влияние на развитие животноводства) вследствие различий между популяциями сельскохозяйственных животных России и зарубежных стран, а именно, (1) различий в условиях внешней среды (кормление, содержание, технологии, климат), (2) различий в генетической структуре популяций (генетическом разнообразии), (3) отсутствия или недостаточные генетические связи между российскими и зарубежными стадами (оценка «эффекта стада» затруднена); (4) разных подходов в определении признаков; (5) различных способах измерения хозяйственно-полезных признаков между популяциями сельскохозяйственных животных России и зарубежных стран.
Преимуществом отечественных производителей по сравнению с зарубежными является способность более быстрого реагирования на требования рынка и способность корректировки созданных тест-систем и оказываемых на основе их использования услуг по результатам генетического мониторинга популяций животных.
Уникальностью предлагаемых исследований является использование комплексного подхода (использование различных типов полиморфизмов) для решения цели проекта (повышение генетического потенциала продуктивности животных), а так же его оптимизацию для российской популяции скота.
Характеризуя новизну поставленной задачи, следует отметить, что впервые:
2.3.1. будут предложены инструменты для генетического совершенствования молочного крупного рогатого скота, адаптированные для российской популяции, в частности, выявлены новые уникальные полиморфизмы, ассоциированные с хозяйственно- и экономически значимыми признаками российской популяции молочного крупного рогатого скота, будут получены данные о силе влияния идентифицированных SNP на изучаемые признаки, будет дана оценка прикладной значимости для селекции молочного скота ранее идентифицированных полиморфизмов и определен спектр полиморфизмов, требующих внедрения в селекционные программы;
2.3.2. реализация проекта позволит перевести на качественно новый уровень выполнение прикладных НИР в области разведения и селекции сельскохозяйственных животных, что существенно повысит результативность селекционно-племенной работы с молочным скотом;
2.3.3. будут поданы заявки на получение не менее 3-х патентов РФ.

2.4. Анализ тенденций развития науки в области оценки генетических ресурсов животных показывает, что направления проводимых исследований напрямую связаны с развитием методов исследований. С начала 2000 гг. в качестве метода анализа используется полногеномный анализ и наблюдается смещение приоритетов исследований в направлении разработки геномных технологий оценки генетических ресурсов животных с целью повышения эффективности их использования.
Данный проект направлен на методическое и методологическое обеспечение разработки и внедрения в стране технологий генетической селекции, адаптированных для российских популяций скота России, посредством моделирования панелей молекулярно-генетических маркеров и разработки систем их идентификации с использованием технологий генного и полногеномного анализа для раннего отбора животных по хозяйственно- и экономически значимым признакам как основы создания в стране устойчивых систем производства продукции животноводства.
В основе технологий геномной селекции лежит использование информации о связи десятков тысяч полиморфизмов единичных нуклеотидов (SNP) с локусами количественных признаков (QTL), ответственными за проявление продуктивных признаков. Использование геномной информации позволяет существенно повысить точность оценки племенной ценности и, как следствие, эффективность селекции. Результаты работы по проекту будут сопоставимы с лучшими мировыми аналогами.
2.5. Развитие исследований в области генетического совершенствования сельскохозяйственных животных связывают с углублением исследований в области геномной оценки, вовлечению в исследования новых типов полиморфизмов (например, вариации числа копий, мутаций с потерей функций и д.р.), разработки межпородных технологий геномной оценки, что находится в полном соответствии с целями и задачами настоящего проекта.
Отсутствие совершенных методов оценки племенной ценности животных является одним из главных факторов, сдерживающих рост продуктивности животных и, как следствие, обуславливающих относительно низкую эффективность молочного животноводства в стране.
Если в развитых странах от одной коровы в год получают 8-10 тонн молока (например, в США - 9,8 тонн), то в РФ этот показатель практически в 3 раза ниже (3,5 тонн). Относительно низкая эффективность производства молока в РФ обуславливает тот факт, что потребление молока (и молочных продуктов в пересчете на молоко) на человека в РФ составляет лишь около 240 кг в год (по данным Росстата), что составляет ок. 65% от медицинской нормы (по данным Института питания РАМН) и лишь треть от того объема, что потребляют в странах Европы - Финляндии, Франции, Германии и США (по данным Национального союза производителей молока). Частично проблема дополнительного обеспечения населения России продуктами питания животного происхождения решается за счет импорта товарных животных, сырья и продуктов питания. Проблема увеличения продуктивности животных в РФ решается, главным образом, за счет импорта племенного материала. Так, более половины быков-производителей, используемых в стране, завезены из-за рубежа. Однако такая стратегия не обеспечивает решение проблемы стабильного поступательного роста продуктивности животных в РФ и эффективности производства продукции животноводства. Кроме того, импорт племенного скота сопряжен с высокими материальными затратами (стоимость 1 головы племенного КРС составляет ок. 8000 USD), с другой стороны, связан с риском завоза животных - носителей наследственных и инфекционных заболеваний, что в конечном итоге, может поставить под угрозу биобезопасность страны.
Таким образом, отсутствие современной научно-обоснованной методологии генетической оценки племенного скота является одним из основных факторов, сдерживающих технологическое развитие животноводства страны.
Преимуществом данного проекта по сравнению с другими является его комплексность, что позволит увеличить результативность технологии генетической селекции в целом за счет повышения доли изменчивости хозяйственно- и экономически-значимых признаков, которая может быть объяснена с использованием молекулярно-генетических маркеров.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
3.1. Результаты проекта будут востребованы в агробиотехнологиях, в создание устойчивых систем производства сельскохозяйственной продукции на основе разработки, совершенствования и внедрения эффективных методов генетической селекции животных, направленных на повышение генетического потенциала быков за счет возрастания точности геномной оценки; создание баз данных, содержащих информацию о геноме пород сельскохозяйственных животных за счет роста эффективности сельскохозяйственного производства, сохранения продовольственной безопасности и поддержания ресурсного потенциала страны.
3.2. В ходе выполнения проекта будет сформировано методическое и методологическое обеспечение разработки и внедрения в стране технологий генетической селекции, основанных на методах генного и полногеномного анализа и адаптированных для российских популяций скота, посредством моделирования панелей молекулярно-генетических маркеров и разработки систем их идентификации для раннего отбора животных по хозяйственно- и экономически значимым признакам как основы повышения эффективности сельскохозяйственного производства.
3.3. Разработка биотехнологий, направленных на повышение эффективности использования биоресурсов для производства продукции животноводства, является одной из приоритетных задач научно-технологического развития в мире. Особую актуальность это приобретает вследствие наметившейся в последние годы в мировой практике тенденции сокращения биоразнообразия сельскохозяйственных животных, в основном из-за меняющихся требований рынка и интенсификации сельского хозяйства, а так же снижение темпов роста продуктивности животных.
Так, проектом Рамочной программы исследований и инноваций Евросоюза на 2014-2020 гг. "Горизонт-2020" (H2020) в области обеспечения безопасности пищи (H2020-SFS) предусмотрено проведение исследований, направленных на создание устойчивых систем производства продуктов питания (SFS-1-SFS-11), конечной целью которых является увеличение на 20% эффективности использования ресурсов (дорожная карта эффективного использования Европейских ресурсов) и предотвращение к 2020 году наметившейся тенденции снижающегося роста первичного производства пищевого сырья. При этом для обеспечения прогресса в разработке устойчивых систем производства продуктов питания приоритеты в исследованиях стран Евросоюза при отборе проектов 2014 года будут направлены на поддержание разнообразия генетических ресурсов для производства пищи, а приоритеты 2015 года будут сфокусированы на улучшении продуктивности животных и совершенствовании генетики для устойчивого производства пищевых продуктов (H2020). С учетом мирового опыта разработки проекта станут фундаментом для создания устойчивых систем производства продукции животноводства, что является актуальной приоритетной задачей для РФ. исходя из выше очерченных экономических (повышение эффективности производства продукции животноводства) и социальных (повышение объемов производимой животноводческой продукции, достижение медицинских норм потребления животных продуктов) причин, а так же принимая во внимание сохранение безопасности страны (продовольственная безопасность), разработка инновационных агробиотехнологий оценки и генетического совершенствования сельскохозяйственных животных (в частности, крупного рогатого скота молочных пород). Полученные результаты проекта будут оперативно представляться на профильных международных зарубежных (в рамках международного сотрудничества) и международных российских конференциях, симпозиумах и конгрессах, научно-практических семинарах; оперативно интегрироваться в профильные курсы преподавания для студентов бакалавриатов и магистратур по направлениям сельскохозяйственная биотехнология, ветеринария, биоинформатика (в рамках развития системы демонстрации и популяризации науки).

Текущие результаты проекта:
4.1. Основываясь на результатах анализа 77 информационных источников выполнен аналитический обзор по теме проекта.
Проведен патентный поиск, по результатам которого для дальнейшего анализа отобрано 24 источника. Выполнен анализ эволюции методов оценки животных по хозяйственно- и экономически-значимым признакам. Проведен анализ геномных регионов, ассоциированных с селекционно-значимыми признаками крупного рогатого скота и в частности с фертильностью. Обоснованы направления исследований и выбраны методические подходы идентификации маркеров для включения в разрабатываемые модели панелей, включающие: идентификацию ДНК-маркеров на основании их локализации в локусах количественных признаков (QTL) – позиционные гены-кандидаты; на основании их потенциального биологического влияния на оцениваемый признак (функциональные гены-кандидаты); на основании результатов проведенных экспериментальных исследований быков-производителей по более 50 тыс. полиморфизмам единичных нуклеотидов и ассоциативных исследований; для маркеров фертильности – на основании наличия ожидаемых частот встречаемости LoF-мутаций в изучаемой популяции быков-производителей по результатам проведенного анализа встречаемости скрытых носителей LoF-мутаций в поколениях предков.
Сформирована экспериментальная популяция быков-производителей (выборка 1), включающая 96 животных. На основании данных о продуктивности их дочерей (n=22154) выполнена оценка их племенной ценности (EBV) по изучаемым признакам - признакам продуктивности и фертильности. Выполнено генотипирование 96 быков-производителей по 54609 полиморфизмам единичных нуклеотидов (SNP) и проведен контроль качества, по результатам которого для анализа ассоциаций отобраны 41442 полиморфизма. Определены 8 молекулярно-генетических маркеров для включения в разрабатываемую панель "Фертильность". При этом ДНК-маркеры, содержание LoF-мутации представлены генами: FANCI (Анемия Фанкони, комплементарная группа I), APAF1 (Апоптотический протеаза-активирующий фактор 1), SMC2 (Белок структурного поддержания хромосом 2), GART (Фосфорибозил-глицинамид-синтетаза), SLC35A3 (Член А3 семейства транспортеров растворенных веществ 35), ITGB2 (Бета-интегрин); ДНК-маркеры, отобранные по результатам полногеномных ассоциативных исследований: GPR161 (G-белок связанный рецептор 161); ДНК-маркеры - функциональный ген-кандидат: BLG (бета-лактоглобулин)
Выполнено теоретическое моделирование тест-систем анализа полиморфизма молекулярно-генетических маркеров, включенных в панель "Фертильность" – маркера BLG (методом ПЦР-ПДРФ анализа), SLC35A3 (ННС) (ПЦР-ПДРФ анализ с созданием специфического сайта рестрикции посредством введения нуклеотидной замены в праймер; ПЦР с последующим пиросеквенированием участка последовательности, содержащего мутацию) и ITGB2 (ННВ) (ПЦР-ПДРФ анализ); SLC35A3+ITGB2 (Дуплексный ПЦР с последующим дуплексным пиросеквенированием последовательностей, содержащих мутации (для одновременной детекции мутаций в генах SLC35A3 и ITGB2); FANCI (ННО) (1-я ПЦР с 2-я наружными праймерами, и одним праймером (fw), локализованным внутри делеции; 2-я ПЦР с 2-я наружными праймерами, и одним праймером (rw), локализованным внутри делеции); APAF1 (НН1) (ПЦР-ПДРФ анализ с исключением неспецифического сайта рестрикции посредством введения замены в праймер); SMC2 (НН3) (Двунаправленная аллелеспецифическая ПЦР); GART (НН4) (ПЦР-ПДРФ анализ с созданием специфического сайте рестрикции и исключением неспецифического сайта рестрикции); GPR161 (ПЦР-ПДРФ анализ с созданием специфического сайта рестрикции посредством введения нуклеотидной замены в праймер; пиросеквенирование).
Разработан проект требования для включения быков-производителей в экспериментальные популяции, включая требования к породной принадлежности и чистопородности быков-производителей, включенных в референтную популяцию; требования к перечню оцениваемых признаков; требования к пороговым значениям оцениваемых признаков; требования к методам расчета племенной ценности (EBV) по оцениваемым признакам; требования к достоверности оценки племенной ценности; требования к популяции дочерей быков с законченной 1-й лактацией, используемых для оценки; требования к генотипам быков-производителей по генам белков молока, содержащим LoF-мутации. Выполнены экспериментальные исследования 96 быков-производителей экспериментальной популяции (выборка 1) по 12 микросателлитным маркерам и определена их генетическая породная принадлежность с использованием способа, описанного в патенте № 2449088; выполнено исследование 96 быков-производителей по SNP-маркеру BLG с использованием способа, описанного в патенте № 2477607.
Новизна проведенных исследований заключается в том, что впервые разработаны теоретические модели тест-систем для анализа LoF-мутаций, освобождающие от необходимости использования чипов, пригодные для массового скрининга; идентифицированы полиморфизмы, достоверно ассоциированные с признаками фертильности на российской популяции крупного рогатого скота.